血清隐球菌荚膜多糖抗原检测和呼吸介入方法在肺隐球菌病中的诊断价值

袁成 丁明

(东南大学附属中大医院呼吸与危重症医学科，南京 210009)

肺隐球菌病(pulmonary cryptococcosis, PC)主要是指经过呼吸道吸入环境中的新生隐球菌或格特隐球菌引起的急性、亚急性或慢性肺部真菌病。近年来，随着检测技术及诊疗技术的进步，PC发病率呈逐年增加的趋势。在呼吸内科诊断的侵袭性肺真菌病(IPA)中，PC占据了相当大的比例。根据IPA的指南要求，确诊IPA必须要有相应的组织病理学诊断。目前，呼吸科取材的主要手段是超声引导下经支气管镜肺活检(EBUS-TBLB)和CT引导下经皮穿刺肺活检，然而很少有研究比较这两种取材手段在确诊PC方面的价值。而且，由于这两种取材方式都具有一定的创伤，临床上更多采用血清隐球菌荚膜多糖抗原(CrAg)检测这一种无创方法作为筛查的手段，既往研究表明其对隐球菌感染具有很高的诊断价值。将无创的筛查手段和不同的有创手段相结合，比较其诊断效能的报道目前还不多。本研究回顾性分析了41例确诊病例，比较了以上3种方法在诊断PC方面的效能，并分析影响诊断敏感性的因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从东南大学附属中大医院医生工作站病案首页综合查询界面—诊断信息查询，诊断名称输入“隐球菌”，时间界定为2015年1月至2020年12月，排除重复病例，共搜索到54例信息，经过筛选，有6例为隐球菌性脑膜脑炎，2例误诊为PC(经抗真菌无效后，1例手术病理确诊为组织胞浆菌病，1例CT引导下经皮穿刺肺活检确诊为肺腺癌)，5例为临床诊断PC，无病理学证据。选择病理学确诊为PC的病例，共41例，收集患者一般资料、临床病史、病理报告、有创操作方法、血清隐球菌荚膜多糖抗原检测报告、免疫抑制剂使用情况、具体治疗方法及有效性。

1.2 方法

血清隐球菌荚膜多糖抗原检测 采用乳胶凝集试验检测隐球菌荚膜多糖抗原滴度，滴度判断标准为≥1∶8为阳性，1∶2或1∶4为弱阳性。

超声引导下经支气管镜肺活检 术前根据患者薄层CT大致判断病变部位，一般要求定位至5～6级靶气管，采用局部浸润麻醉联合静脉麻醉，完成常规气管镜检查(Olympus 290)后，将超声小探头(Olympus ME2 plus外径1.4 mm)从支气管镜工作孔道送入至目标支气管,出现目标病灶的超声影像后回撤探头，确定病灶部位、深度及周围血管的情况；固定气管镜，助手协助标记超声小探头的位置，直至病灶超声影像消失,助手再作1个标记；固定支气管镜位置不变,撤出超声小探头,助手测量探头探及病灶到支气管镜工作孔道的距离、病灶消失到支气管镜工作孔道口的距离,在活检钳上分别进行标记后,插入工作孔道,进入同一亚段进行反复活检[1]。并使用现场快速细胞学(ROSE)确认取材质量。

CT引导下经皮穿刺肺活检 术前所有患者均需要完成胸部增强CT扫描，明确病变周围血管情况，根据病灶部位确定穿刺时体位及穿刺点。穿刺操作如下：先对患者进行胸部CT扫描,获取CT图像后，规划好最佳穿刺点及穿刺路径，定位好穿刺点后做好标记，局部消毒后，采用2%利多卡因进行局部浸润麻醉, 嘱咐患者屏住呼吸,于穿刺点进针(18G切割针), 沿着预先确定好的穿刺角度进行穿刺，再次进行胸部CT扫描，确定穿刺针抵达病灶内, 拔出针芯，助手将活检枪置入穿刺针内, 快速切取肺部病灶组织1～3次，获取理想组织后，撤出活检枪和穿刺针, 局部压迫后消毒覆盖无菌纱布，将切取的病变组织置入4%甲醛溶液中送病理检查[1]，术毕再进行1次胸部CT扫描明确有无出血及气胸。

病理学检查 病灶活检组织常规4%甲醛溶液固定后，石蜡包埋，组织切片，分别行常规HE染色、过碘酸雪夫(PAS)染色、Gorcott六胺银(GMS)染色和抗酸染色[2]。

1.3 统计学方法

计数资料以率(%)表示，采用卡方(χ2)检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料

41例患者中，HIV检测均为阴性，男性25例，女性16例，年龄21～82岁。患者中有自身免疫性疾病(包含IgM肾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)并使用激素等免疫抑制剂的5例，合并糖尿病5例，肿瘤病史3例，精神分裂症1例，反复湿疹使用激素1例，关节滑膜炎使用免疫抑制剂1例，甲状腺功能亢进1例，其他(高血压病、脂肪肝、脑梗死)5例，无特殊疾病史19例。影像学特点主要表现为斑片影伴有实变26例(63.4%)、多发结节或肿块影10例(24.4%)、单发结节5例(12.2%)。病变主要位于双肺下叶近胸膜下，以单肺/叶多发病变为主。临床症状主要表现为咳嗽25例(52.1%)、发热8例(16.7%)、胸痛4例(8.3%)、胸闷2例(4.2%)、无症状9例(18.8%)。41例患者中有18例行腰椎穿刺术，脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原检测均阴性，墨汁染色均阴性，真菌培养均阴性，18例患者中仅有2例存在免疫抑制状态(关节滑膜炎、甲状腺功能亢进)。除3例手术切除外，其余38例患者均给与氟康唑抗真菌治疗，经胸部CT影像学复查病灶均有部分程度吸收，有效率100%(见表1)。

表1 41例患者临床特点Tab.1 Clinical characteristics of 41 patients

2.2 病理诊断

病理组织活检一般可见肺组织内多灶性组织细胞及多核巨细胞聚集伴肉芽肿形成，其中查见真菌，形态学符合隐球菌，特殊染色：GMS(+)，PAS(+)，抗酸染色(-)，分子病理学：结核分枝杆菌PCR检测阴性。

2.3 敏感性分析

所有纳入分析的患者中，32例行EBUS-TBLB，确诊16例；行CT引导下经皮穿刺肺活检23例，确诊22例；3例外科手术确诊；血清CrAg检测阳性29例(包括弱阳性2例)。3种方法在诊断PC方面的敏感性分别为50%(16/32)、95.7%(22/23)和70.7%(29/41)。联合EBUS-TBLB和血清CrAg检测，其敏感性可提升至96.9%(31/32)。

2.4 胸部CT影像学特点对EBUS-TBLB阳性率的影响

32例行EBUS-TBLB的患者中影像学表现为斑片状渗出伴有实变影的21例，病理阳性12例，敏感性57.1%；表现为单发、多发结节或占位影的11例，病理阳性7例，敏感性63.6%，影像学特点对EBUS-TBLB诊断PC敏感性无影响，卡方值0.126，P=0.513，差异无统计学意义(见图1)。

图1 A.右下肺孤立性结节；B.左下肺多发结节影；C.右下肺斑片状渗出伴实变影；D.左下肺肿块影Fig.1 A. isolated nodules in the right lower lung; B. multiple nodules in the left lower lung; C. patchy exudation with consolidation in the right lower lung; D. mass shadow in the left lower lung

2.5 影响血清隐球菌荚膜多糖抗原检测敏感性因素分析

病变范围的影响 41例患者影像学变现为双肺或单肺/叶多发病变的29例，血清CrAg检测阳性24例，敏感性82.8%；影像学表现为单肺叶单发病变的12例，血清CrAg检测阳性5例，敏感性41.7%，卡方值6.923，P=0.014，差异有统计学意义，表明病变范围越广，血清CrAg诊断PC敏感性越高。

机体免疫状态对敏感性的影响 41例患者中存在免疫抑制状态(包括自身免疫性疾病、糖尿病、肿瘤、湿疹、精神分裂症、关节滑膜炎、甲状腺功能亢进)17例，血清CrAg检测阳性15例，敏感性88.2%；无免疫抑制状态患者24例，检测阳性14例，敏感性58.3%，卡方值4.298，P=0.039，差异有统计学意义，提示机体处于免疫抑制状态时，血清CrAg诊断PC敏感性越高。

3 讨 论

肺隐球菌病(PC)近年来发病率逐年增长，仅次于侵袭性肺曲霉病(IPA)。隐球菌广泛分布于自然界的土壤及动物粪便中，鸽子是隐球菌的天然宿主，直接或间接接触鸽粪会增加隐球菌感染风险[3]。最常感染的部位是中枢神经系统，其次是肺。本研究中18例行腰椎穿刺的患者，脑脊液CrAg检测均为阴性，并发隐球菌脑膜炎概率为0，可能与大多数(16例)患者均无特殊基础疾病有关。PC在免疫功能正常和低下者中均可发生，在我国新诊断的PC中60%为免疫功能正常的非HIV患者[4],其他的高危因素有长期应用免疫抑制剂、长期使用糖皮质激素、接受化疗、器官移植和广谱抗生素等[5]，本病好发于成年人，男性多于女性，儿童及老年人发病少，主要临床症状为咳嗽和发热，胸痛和胸闷症状少见，还有一部分无临床症状[6]，这与本研究结果一致。

PC的CT影像学表现多样，可以表现为斑片状影伴实变、单发或多发结节/肿块。本研究发现其以斑片状渗出伴实变影多见，其次是结节/肿块型，以单肺/叶多发病变为主，再其次是单肺叶单发病变，双肺病变少见，多位于胸膜下，以双下叶常见，这可能是因隐球菌直径较小,人体吸入后易到达细支气管和终末支气管等部位[7]。病灶部位可有晕征、支气管充气征等伴随征象[8]，极少有纵隔淋巴结肿大、空洞和胸腔积液[9]，容易被误诊为肺癌、肺结核及普通肺炎[10]，此型最常见，需要和周围型肺癌和肺结核鉴别；对于多发结节型PC，需要和肺结核和转移性肺癌鉴别[6]。

无菌部位标本病原学涂片及培养阳性、组织病理检查发现隐球菌是确诊的“金标准”，来自呼吸道的分泌物或支气管肺泡灌洗液(BALF)涂片或培养阳性，对临床诊断具有重要价值，但对于免疫功能正常患者，呼吸道取材的分泌物或BALF标本病原学培养阳性率低[3]，而肺穿刺组织较其他标本病原学检查阳性率高。组织标本除常规HE 染色外，还可通过六胺银、过碘酸雪夫染色等特殊染色方法以提高检出率[11]。本研究中所有确诊病例均行六胺银、过碘酸雪夫染色，同时行抗酸染色及分子病理学检查除外结核杆菌感染。临床获取肺组织的方法主要包括：支气管镜检查，CT引导下肺穿刺活检及外科胸腔镜等方式。超声引导下的经支气管镜肺活检，可以极大提高肺活检的阳性率，同时与CT引导下肺穿刺相比较，具有放射线的暴露少、并发症轻微可控、创伤小以及可以反复取材等优势[12]。虽然本研究中，超声引导下的经支气管镜肺活检阳性率不如CT引导下肺穿刺，但在联合血清CrAg检测后可以明显提高其诊断PC的效能。本研究中CT引导下肺穿刺活检术对于PC的诊断敏感性高达95.7%，除CT引导本身的技术优势外，考虑与肺隐球菌病变多位于外周近胸膜下，更加有利于CT引导下的穿刺有关。血清隐球菌荚膜多糖抗原检测，与培养、病理学检查相比，具有检测快速、简便、敏感性和特异性均高的优势，有助于早期筛查，且可用于评估疗效和预后，具有较高的临床应用价值[12]。一项Meta分析显示，血清隐球菌荚膜多糖抗原检测诊断隐球菌感染的总体敏感性和特异性达97.6%和98.1%[13]。本研究中血清隐球菌荚膜多糖抗原检测诊断PC的总体敏感性为70.7%，与王丽芳等[6]的报道相仿，亚组分析发现，肺部病变范围越广，抗原检测阳性率越高。此外，机体存在免疫抑制状态时，抗原检测阳性率也会提高。本研究中检测阳性率偏低的原因可能与58.5%的患者为免疫正常者，导致总体抗原阳性率偏低。近年来，肺泡灌洗液或肺穿刺物进行病原学宏基因组测序(NGS)逐渐应用于临床疑难、危重、特殊病例的诊断和治疗，尽管有研究报道NGS诊断IPA具有快速、精准的优势，但因真菌破壁技术、取材手段的限制等客观原因，NGS用于诊断PC的效能有待进一步验证[3]。

PC治疗主要是控制感染和防止感染播散，对无免疫抑制宿主，即使无症状，也建议给与治疗。对于免疫抑制患者症状多且重，往往伴有高热、气促、低氧血症和呼吸衰竭等表现，病灶易播散，病情进展快，病死率高[14]。具体用药方面，对轻中度症状的患者，推荐氟康唑400 mg/d，疗程6～12个月，对于重症患者建议等同于中枢神经系统感染的方案进行治疗，即两性霉素B或氟康唑联合氟尿嘧啶诱导治疗后，再调整抗真菌治疗的剂量和疗程[15]。本研究除外科手术切除的3例患者，其余38例患者均为轻中度症状，给与氟康唑抗真菌治疗后，有效率达100%。

PC是最常见的肺部真菌感染之一，在免疫功能正常和低下者中均可发生，其症状及肺部影像学无特异性，容易漏诊、误诊。临床高度怀疑肺隐球菌感染时，可选择CT引导下经皮穿刺肺活检明确诊断。联合使用血清隐球菌荚膜多糖抗原检测和超声引导下经支气管镜肺活检可进一步提高诊断PC的效能。对于肺部病变范围广和机体存在免疫抑制状态的患者，仅血清CrAg检测在诊断PC方面也具有很好的敏感性。