MALDI-TOF MS自建数据库对丝状真菌临床分离株鉴定能力的评估

李颖 黄晶晶 刘文静 王培昌 徐英春

(1. 首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053； 2. 中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730；3. 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730)

近年来，曲霉、镰刀菌、接合菌等丝状真菌的临床感染率有升高趋势，在某些特定人群中其感染率甚至超过酵母菌[1-3]。丝状真菌种类繁多，不同种属菌株对常用抗真菌药物的反应多有差别，如土曲霉和尖端赛多孢霉对两性霉素B天然耐药；镰刀菌对棘白菌素类抗真菌药物不敏感，对多数新型唑类药物仅中度敏感；接合菌除对棘白菌素天然耐药外，另有部分菌种对唑类药物耐药[4-6]。所以，对丝状真菌进行准确种属鉴定可以有针对性地指导临床选用抗真菌药物，减少无效或错误用药。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作为微生物快速鉴定分析技术已被成功应用于临床细菌及酵母菌菌种鉴定；但在丝状真菌鉴定方面，其应用程度及鉴定能力略逊。除丝状真菌本身细胞壁厚这一客观因素外，现有的商业丝状真菌质谱鉴定数据库涵盖菌种数不足也是重要原因之一[7-8]。相应地，国际上多个研究机构分别致力于建立本地丝状真菌质谱鉴定数据库，其中规模较大的有Lau AF等研究人员建立的美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)丝状真菌数据库和法国与比利时学者联合建立的大型真菌质谱鉴定(mass spectrometry identification，MSI)平台，通过自建数据库可以有效提升MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定效率[9-12]。2019年由国内多位专家共同编撰的《自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库专家共识》对自建数据库的操作流程及注意事项等方面进行了明确规范与建议[13]。本研究参照该共识建立适当规模的MALDI-TOF MS丝状真菌鉴定本地数据库，拟提高实验室对丝状真菌分离株的鉴定能力。

1 材料与方法

1.1 菌株

建库菌株 整理北京协和医院2014年1月—2016年12月分离自临床患者送检标本的丝状真菌，选取具有代表性的菌种，每一种属菌株数≥1株。建库菌株均采用分子测序技术准确鉴定到种水平，其中曲霉采用钙调蛋白(CaM)基因测序，镰刀菌采用转录延长因子1α(EF-1α)基因测序，接合菌等余下菌种采用内转录间隔区(ITS)测序[14-15]。

评估菌株 收集北京协和医院2016年1月—2017年6月分离自临床患者送检标本的丝状真菌。评估菌株在复苏传代后均经进行形态学鉴定初步确定种属信息。

1.2 试剂材料

Bruker Biotyper AutoflexTMMALDI-TOF MS系统、α-氰基-4-对羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)基质液、BTS标准品均购自德国Bruker Doltanics公司。甲酸和三氟乙酸溶液均购自法国Sigma-Aldrich公司。乙腈溶液购自比利时ACROS Organics公司。真菌用沙堡弱葡萄糖琼脂(Sabouraud dextrose agar，SDA)培养基购自英国OXOID公司，丝状真菌基因组DNA 提取采用德国QIAGEN DNA mini试剂盒。

1.3 Bruker Biotyper自建数据库

自建数据库流程按照Bruker Biotyper用户手册进行：①拟建库菌株的纯培养；将基因测序鉴定明确的丝状真菌菌种以3点式接种SDA平皿置于28℃温箱进行传代培养。②质谱分析前处理；参照《自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库专家共识》建议，分别取培养第2～3天的较幼稚菌落和培养至第5～7天较成熟菌落进行建库操作，具体流程为采用标准甲酸-乙腈提取法对适量菌丝进行前处理，包括75%酒精灭活菌体，甲酸溶液裂解菌体细胞壁，乙腈溶液促进核糖体蛋白释出，吸取1 μL上清点样于Bruker MSP 384靶板，干燥后再滴加1 μL HCCA基质液，每一建库菌株平行点样8次，共8个待分析靶点。③自建数据库质谱图获取；按照用户手册对Bruker MS仪器进行日常校准。每个靶点采集3张高质量质谱图，每一建库菌株共采集24张质谱图。采用Bruker Flex Analysis软件对24张质谱图进行筛选，除去质量较差的谱图，同时保证余下高质量质谱图>20张；若无法满足此条件应重复进行建库质谱图获取。④建立数据库；将>20张高质量质谱图在Bruker Biotyper软件中整合成一张代表性参考质谱图，对该参考质谱图进行菌种信息命名并保存。

1.4 Bruker Biotyper自建数据库鉴定能力的评估

采用临床丝状真菌分离株对该MALDI-TOF MS自建库的鉴定能力进行评估，操作流程同标准提取法MALDI-TOF MS鉴定。数据库分别选用Bruker商业丝状真菌数据库(Bruker Filamentous fungi Library 1.0)、本地自建数据库(In-house database)和二者联合数据库(Combined database)，根据鉴定率差异来评估最优数据库模式。MALDI-TOF MS鉴定结果判读标准为：鉴定分值≥2.000，种水平鉴定正确；鉴定分值1.700～1.999，仅属水平鉴定正确；鉴定分值<1.700则为无法鉴定。对于曲霉评估菌株，MALDI-TOF MS鉴定结果与形态学鉴定结果一致即认为鉴定准确，对于鉴定结果不一致(包括一种方法鉴定至属水平而另一种方法鉴定至种水平或两种方法均鉴定至属水平)的菌株则进一步采用CaM基因测序鉴定；对于非曲霉丝状真菌，无论MALDI-TOF MS鉴定结果与形态学鉴定结果一致与否均采用ITS或EF-1α基因测序明确菌株种属信息。

1.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件；本研究数据类型为多项有序分类变量，多样本比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，两样本间比较采用Wilcoxon秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义[16]。

2 结 果

2.1 MALDI-TOF MS自建数据库概况

建库菌株41株，其中曲霉22株，12种；镰刀菌3株，2种；接合菌7株，5种；其他菌株9株分属于6个不同种(见表1)。对每一建库菌株分别取SDA培养2～3 d(幼稚)和5～7 d(成熟)菌落进行自建库处理，共得到参考质谱图82张。

表1 Bruker MALDI-TOF MS自建数据库菌株列表Tab.1 Lists of strains with mass spectra profiles in the MALDI-TOF MS in-house database

2.2 MALDI-TOF MS自建数据库的鉴定能力评估

评估用丝状真菌临床分离株236株，其中曲霉200株，非曲霉丝状真菌36株。按照Bruker推荐的鉴定结果判定标准，Bruker商业丝状真菌数据库(简称Bruker Library)仅可将29.2% (69/236) 评估菌株鉴定至种水平，47.9% (113/236) 菌株鉴定至属水平，22.9% (54/236) 菌株因鉴定分值<1.700而无法鉴定。采用本研究自建数据库，67.5% (159/236) 受试菌株因其鉴定分值≥2.000可实现种水平鉴定，另有19.9% (47/236) 菌株可实现属水平鉴定。将Bruker Library与本研究自建数据库联合后，76.3% (180/236) 受试菌株可实现种水平鉴定，19.1% (45/236) 菌株可实现属水平鉴定，仅4.6% (11/236) 菌株无法鉴定(见表2)。经统计学分析，3种数据库模式间对评估菌株的鉴定能力存在显著性差异(χ2=116.447，P<0.001)；除Bruker Library鉴定能力显著低于自建数据库和联合数据库外，联合数据库的鉴定能力要优于单独应用自建数据库(Z=-2.478，P=0.013)。本研究中，Bruker Library在受试菌株种水平鉴定结果存在1个错误鉴定情况(1株塔宾曲霉被错误鉴定为黑曲霉，鉴定分值2.041)；应用自建数据库，在提高了受试菌株种水平鉴定率的同时并未导致种水平错误鉴定情况发生；将Bruker Library和自建数据库联合应用后，种水平鉴定率为三者间最高且仍保持良好的种水平鉴定准确率。

表2 MALDI-TOF MS自建数据库对丝状真菌临床分离株鉴定能力的评估Tab.2 Evaluation of the MALDI-TOF MS in-house database in identification of clinical filamentous fungi isolates n(%)

2.3 丝状真菌形态学鉴定与MALDI-TOF MS鉴定能力比较

以联合数据库为Bruker MALDI-TOF MS鉴定用数据库，将评估菌株MALDI-TOF MS鉴定结果与形态学鉴定结果进行比较，形态学方法将81.4% (192/236) 菌株鉴定到种水平，其中有4.2% (8/192) 菌株在种水平鉴定错误，故形态学方法对受试丝状真菌的种水平鉴定准确率为95.8% (184/192)。MALDI-TOF MS联合数据库对受试丝状真菌的种水平鉴定率为76.3% (180/236)，略低于形态学方法，但不存在种水平鉴定错误的情况，即种水平鉴定准确率为100%。进一步分析，对于临床常见曲霉分离株，MALDI-TOF MS较形态学方法并未展现出鉴定优势[80.7% (175/181)vs.96.7% (146/181)]；对于少见曲霉种和非曲霉丝状真菌，MALDI-TOF MS的鉴定能力显著优于形态学方法，鉴定准确率更高[16.4% (9/55)vs.61.8% (34/55)，Z=-3.110，P=0.002]。(见表3)。

表3 形态学方法与MALDI-TOF MS联合数据库对丝状真菌鉴定能力的比较Tab.3 Comparison of the performance of morphological method and MALDI-TOF MS with the combined database in identification of filamentous fungi isolates n(%)

3 讨 论

数据库的完备与更新是保障MALDI-TOF MS实现病原微生物准确鉴定的重要前提。对于丝状真菌，明确菌株种属信息有助于区分潜在致病菌及污染菌。本研究将41株具有临床代表性的丝状真菌进行MALDI-TOF MS自建数据库，显著提升实验室对丝状真菌分离株的鉴定能力。

Bruker MALDI-TOF MS商业丝状真菌数据库中包含127种丝状真菌参考质谱图，但其菌种涵盖范围与临床丝状真菌分离谱存在一定偏差。用于本研究MALDI-TOF MS自建数据库的41株25种丝状真菌中有9株5种在Bruker商业数据库中缺乏参考质谱图。另一方面，Bruker商业数据库采用丝状真菌液体培养法生长的菌丝进行建库，对待鉴定菌株建议进行20 h液体培养，或在丝状真菌固体培养菌落较幼稚时进行MALDI-TOF MS鉴定；菌落成熟后其质谱图较幼稚菌落时存在差异性特征峰，导致此时Bruker商业数据库鉴定效果稍逊[17-18]，这与国内大多数微生物实验室丝状真菌培养鉴定流程不相符。本研究参照《自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库专家共识》，对固体培养法丝状真菌幼稚菌落和成熟菌落分别进行MALDI-TOF MS自建数据库处理，得到的参考质谱图可以基本满足常规工作中丝状真菌鉴定需求。采用236株丝状真菌临床分离株对该自建数据库进行性能评估，自建数据库以及自建库联合Bruker商业数据库的鉴定能力均优于Bruker商业数据库，其中以联合数据库的鉴定能力最为出色，种水平鉴定率76.3%(180/236)，另有19.1%(45/236)菌株可实现属水平鉴定，仅4.6%(11/236)菌株无法鉴定。对于联合数据库下45株仅实现属水平鉴定的菌株，经与基因测序鉴定结果比对，有44株MALDI-TOF MS鉴定结果在种、属水平均正确但鉴定分值介于1.700～1.999之间，如何将这一部分菌株的MALDI-TOF MS鉴定结果提升至种水平鉴定范畴值得后续进一步探讨。Sleiman等[19]研究表明，下调种水平鉴定截断值至≥1.800可显著提高Bruker商业数据库对丝状真菌的鉴定能力，但对自建数据库以及联合数据库的鉴定能力影响较小；更新数据库参考质谱图较下调种水平鉴定截断值更能有效提高MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定能力。

形态学方法因其操作简便、低成本等特点在丝状真菌菌种鉴定方面仍占有重要地位，特别是对于临床常见的具有特征性结构的丝状真菌，如烟曲霉、构巢曲霉等，形态学方法多能实现种水平鉴定。但是对于少见或缺乏特征性结构的丝状真菌，亦或因患者接受抗真菌药物治疗致使分离菌株形态发生变异，此时形态学方法易出现无法鉴定或错误鉴定的情况，需要借助基因测序技术或MALDI-TOF MS鉴定菌株信息。本研究中，55株曲霉少见种和非曲霉丝状真菌经形态学方法有30.9%(17/55)菌株鉴定至种水平，但种水平鉴定错误率较高(47.1%，8/17)。采用MALDI-TOF MS自建数据库，61.8%(34/55)菌株可实现种水平鉴定且无错误鉴定情况，种水平鉴定率及准确率均显著高于形态学方法。此外，MALDI-TOF MS自建数据库在丝状真菌菌种鉴定的检测时长和检测成本上也具有一定优势，特别是建立包含菌株不同生长阶段的参考质谱图，可以对不同时段的临床分离菌株进行鉴定；自建数据库的检测能力虽不及基因测序技术，但检测成本及可操作性要优于基因测序技术，适合在临床常规工作中开展。

综上，MALDI-TOF MS自建数据库有助于提高实验室丝状真菌鉴定能力，特别是对于形态学方法鉴定困难的少见丝状真菌。对自建数据库进行不断完善和菌种扩充是保证该技术满足临床菌种鉴定需求的重要助力。