C3aR在调节人壁层肾祖细胞源性的足细胞再生中的作用和机制研究*

杨 静， 叶璐霞， 王莎莎△

（1苏州大学附属第一医院肾内科，江苏苏州215000；2浙江省台州医院，浙江临海317000）

肾小球疾病是严重危害人类健康的疾病，肾小球硬化是各种肾小球疾病进展的共同结局。据统计，85%以上的终末期肾衰因肾小球疾病所致［1］。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，在维持肾脏的正常结构和功能中起着关键作用。足细胞的损伤和数量减少是导致肾小球滤过屏障破坏，以及肾小球硬化的重要原因［2］。

成熟的足细胞为一种高度结构化的终末期分化细胞，缺乏再生能力，受到损伤后不能靠其自身的增殖而得到补充［3］。肾祖细胞是体内的多分化潜能细胞，其中研究得最多的是存在于包曼氏囊壁上的壁层肾祖细胞（CD24+CD133+parietal epithelial cell，CD24+CD133+PEC），它不仅可通过增殖实现自我更新，而且可分化为足细胞以补充其丢失［4-5］。CD24+CD133+PEC 主要分布于尿极包曼氏囊壁，其主要表型特征是表达干细胞标记分子CD24 和CD133［6］。

C3a 受体（C3a receptor，C3aR）是补体C3 裂解产物C3a 的受体，最早被发现表达于多种骨髓源性的免疫细胞，参与免疫细胞的趋化和激活。近年来有研究表明C3aR 也表达于包括脑、肝、肺和肾脏等多种器官中的固有细胞，表现出多种多样的非免疫功能。一些研究提示C3aR 可能参与了包括糖尿病肾病和局灶节段性肾小球硬化在内的多种肾脏疾病的病理过程［7-11］，但其确切分子机制未明。C3aR 在CD24+CD133+PEC 中的作用未明，本项工作通过构建C3a 分泌性表达慢病毒并感染CD24+CD133+PEC，以探讨C3aR 在CD24+CD133+PEC 的增殖及其向足细胞分化中的作用及可能机制。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞 CD24+CD133+PEC 从人肾脏组织标本中提取，标本来自台州恩泽医疗中心（集团）台州医院肾透明细胞癌患者切除的癌旁组织。患者纳入标准：（1）病理确诊为肾透明细胞癌；（2）术前未经过辅助放化疗。排除标准：（1）并发其他肿瘤；（2）合并原发性或继发性肾小球肾炎。实验流程和方法均已通过台州恩泽医疗中心（集团）台州医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书，伦理委员会批准编号为K20191201。

1.2 药品 维生素D3和全反式视黄酸购于Sigma。

1.3 试剂 DMEM/F12培养液购于Gibco；EBM-2培养液购于Lonza；胎牛血清购于VWR；Trizol购于Invitrogen；逆转录试剂盒购于TaKaRa；SYBR Green 染料购于碧云天公司；PCR 引物由上海吉凯基因化学技术公司合成；CCK-8 试剂盒购于美仑生物公司；Wilms 肿瘤蛋白1（Wilms tumor protein 1，WT1）抗体、ERK1/2 抗体、p-ERK1/2 抗体购于 CST；E-cadherin 抗体购于 Proteintech；C3aR 抗体购于 Genetex；ELISA试剂盒购于Elabscience。

1.4 仪器 CO2培养箱、酶标仪（ThermoFisher Scientific）；凝胶成像系统（GE Healthcare Life Sciences）；激光共聚焦显微镜（ZEISS LSM800）。

2 方法

2.1 CD24+CD133+PEC 的分离培养及诱导向足细胞分化 用文献报道的方法［12-13］取人肾组织皮质标本依次通过 60 目、80 目、100 目和 150 目筛网，并于150目筛网上收集肾小球于含20%胎牛血清的EBM-2培养液中进行原代培养，并利用磁珠分选法筛选表达CD24 和CD133 单细胞克隆，得到CD24+CD13+PEC。CD24+CD133+PEC 向足细胞的诱导分化于分化培养液VRAD（含10%胎牛血清、100 nmol/L 维生素 D3 和 100 μmol/L 全反式视黄酸的 DMEM-F12 培养液）中进行。培养1～3 d，根据足细胞特异性标记分子WT1 的表达情况判断是否完成足细胞的诱导分化。

2.2 C3a 分泌性表达载体的构建和重组慢病毒包装 用文献［14］报道的C3a 分泌表达重组基因，构建C3a 分泌性表达载体pCDH-CMV-C3a-EF1-CopGFPT2A-Pu，与包装质粒共转染293T细胞，包装成C3a表达重组慢病毒。收集病毒原液于-80 ℃保存备用。

2.3 病毒感染细胞 CD24+CD133+PEC 按细胞密度 4×108/L 接种于 6 孔板，将细胞分为 3 组：C3a 过表达组、空载体组（NC 组）和未感染组（CD24+CD133+PEC 组）。待细胞融合度达到70%时，C3a 表达重组慢病毒及空载体NC 重组慢病毒按照MOI 值为5 的比例稀释病毒，加入8 mg/L 的Polybrene。转染48 h后，以1∶3的比例接种于细胞培养瓶，并加入10 mg/L嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞。

2.4 ELISA 法检测C3a 表达水平 根据人C3a ELISA 试剂盒说明书，检测细胞培养上清液中C3a 的浓度。

2.5 CCK-8 法检测细胞活力 稳定转染的细胞重悬后以每孔1×104的密度接种于96 孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，吸掉培养液，加入10 μL CCK-8 检测液和 90 μL 培养液，于培养箱孵育 2 h，每组设置5 个复孔。用酶标仪在450 nm 处检测吸光度（A）值。

2.6 细胞免疫荧光染色 细胞爬片于预冷的4%多聚甲醛、4 ℃固定 20 min，PBS 洗涤后，0.1% TrionX-100 室温透化 10 min，再经 5%BSA 封闭 30 min，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤后Ⅱ抗避光孵育1 h，DAPI染色5 min，滴加抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察，采集图像。

2.7 罗丹明-鬼笔环肽染色 细胞爬片于预冷的4% 多聚甲醛、4 ℃固定 20 min，PBS 洗涤后，0.1%TrionX-100 室温透化10 min，罗丹明-鬼笔环肽染色1 h，经 PBS 洗涤后 DAPI 染色 5 min，滴加抗荧光淬灭剂封片。激光共聚焦显微镜观察，采集图像。

2.8 RT-qPCR 检测 采用Trizol 试剂提取细胞总RNA，用逆转录试剂盒PrimeScript™RT Master Mix（Perfect Real Time）合成 cDNA。将 cDNA、引物和SYBR Green 染料加入反应体系中，按照试剂盒说明书进行RT-qPCR 检测。RT-qPCR 反应条件为95 ℃2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循环 40 个周期。C3a 的上游引物序列为5’-AAGTCGGCAAGTACCCCAAG-3’，下游引物序列为 5’-AGTTGCAGCAGTCCAGGAAG-3’；C3aR 的上游引物序列为 5’-TGGTGGCTGTCTTTCTTGT-3’，下游引物序列为 5’-CTGCCTTGCTTTCTTCCTA-3’；WT1 的上游引物序列为 5’-GAGCGATAACCACACAACG-3’；下游引物序列为5’-ATGCCGACCGTACAAGAG-3’。所有样品重复检测3次，2-ΔΔCt法计算相关基因的表达情况。

2.9 Western blot 检测 细胞蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度后制备样品，电泳分离目的蛋白，转膜。5%牛奶室温封闭2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤后Ⅱ抗室温孵育1 h，化学发光仪检测，ImageJ分析条带灰度值。

3 统计学处理

所有数据采用SPSS 20.0 软件进行分析。正态分布连续变量用均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较用t检验或单因素方差分析；非正态分布连续变量用中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Man-Whitney 或Kruskal-Wallis 检验。所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 原代提取CD24+CD133+PEC并鉴定

从人肾组织皮质标本分离的肾小球接种后第3天在正置显微镜下观察到肾小球周围有细胞爬出；然后分别在第7 天和第10 天观察到细胞数量增多；在第21 天观察到细胞几乎铺满培养皿，细胞胞体变圆且透亮（见图1A）。磁珠分选法筛选CD24+CD133+PEC，并利用免疫荧光染色来鉴定CD24+CD133+PEC，呈绿色荧光的为 CD24+CD133+PEC（见图1B）。

Figure 1. Isolation and identification of the primary CD24+CD133+ PECs. A：after the isolated glomeruli cultured for 3，7，10 and 21 days，the number of cells gradually increased，and the cell bodies became round and transparent（scale bar=200 μm）；B：immunofluorescence staining indicated that CD24 and CD133 were positive for CD24+CD133+ PECs and negative for the controls（scale bar=100 μm）.图1 原代CD24+CD133+PEC分离及鉴定

2 诱导CD24+CD133+PEC向足细胞分化并鉴定

CD24+CD133+PEC 于分化培养液VRAD 中诱导向足细胞分化，如图2 所示，未分化的CD24+CD133+PEC 胞体圆润，细胞排列紧密，分化后的CD24+CD13 3+PEC 数量减少，且长出伪足。如图3 所示，分别用Western blot、免疫荧光染色和RT-qPCR 在分化的3 d内检测了细胞中WT1 的表达，结果显示分化后的细胞中WT1 均高于未分化的CD24+CD133+PEC，且在分化第2 天有最高的表达（P＜0.05）。通过细胞骨架染色观察分化后的细胞形态变化，与未分化的CD24+CD133+PEC 相比，分化后的细胞胞体变大，且有伪足伸出，见图4。

Figure 2. After the CD24+CD133+ PECs differentiation for 1，2 and 3 days，the number of cells gradually decreased and pseudopods emerged. Scale bar=200 μm.图2 CD24+CD133+PEC分化前3天，细胞数量逐渐减少，细胞长出伪足

3 C3aR 在CD24+CD133+ PEC 向足分化过程中的表达变化

通过Western blot 在蛋白水平检测未分化及分化 1～3 d 的 CD24+CD133+PEC 中 C3aR 的表达情况，图 5A 提示 C3aR 蛋白在分化后 1、2、3 d 的细胞中的表达水平显著降低（P＜0.05），图5B～D提示通过免疫荧光染色和RT-qPCR 检测细胞中C3aR 的表达情况均得到与Western blot相同的结果。

4 C3a分泌性表达慢病毒感染细胞并鉴定

经嘌呤霉素筛选后的细胞于倒置荧光显微镜下观察病毒转染情况，如图6 所示，NC 组和C3a 过表达组均有较强的荧光。通过RT-qPCR 对C3a 的mRNA表达水平进行分析，C3a 过表达组中C3a 的mRNA 表达水平显著高于 CD24+CD133+PEC 组和 NC 组（P＜0.01）。分离细胞培养液上清，通过ELISA 检测上清中C3a 的含量，C3a 过表达组的C3a 的含量显著高于CD24+CD133+PEC组和NC组（P＜0.01），见图7。

5 C3a 过表达促进细胞增殖和并抑制其向足细胞分化

通过CCK-8 检测细胞的活力，结果显示，C3a 过表达组细胞的增殖能力较CD24+CD133+PEC 组和NC 组显著增强（P＜0.01），见图8A。通过Westernblot检测细胞诱导分化第2天时WT1和E-cadherin的蛋白表达，C3a 过表达组的WT1 蛋白表达较CD24+CD133+PEC 组和 NC 组显著降低，E-cadherin蛋白表达较CD24+CD133+PEC 组和NC 组显著升高（P＜0.01），见图8B～D。

6 C3a过表达激活ERK通路

通过Western blot 检测在细胞诱导分化2 d 时ERK1/2 信号通路相关蛋白表达水平，C3a 过表达组p-ERK1/2 蛋白表达较 CD24+CD133+PEC 组和 NC 组显著升高（P＜0.01），见图9。

讨 论

足细胞为附着在肾小球基底膜外侧的脏层上皮细胞，与内皮细胞、肾小球基底膜构成肾小球滤过屏障［15］。与其他固有肾小球细胞相比，足细胞不能充分增殖以替代疾病中耗尽的细胞。近年的研究已证实了包曼氏囊壁中CD24+CD133+PEC 的存在，CD24+CD133+PEC 在特定病理生理条件下，可增殖并进而分化为成熟的足细胞来补偿损失的肾小球足细胞。Miesen 等［4］和 Shankland［5］等通过体外分化实验证实CD24+CD133+PEC 可增殖分化为肾小球足细胞。一些基于模型动物的研究显示，CD24+CD133+PEC 增殖和分化异常可能是导致包括FSGS 等疾病由足细胞损伤最终进展到肾小球硬化的重要原因，而改善CD24+CD133+PEC 源性的足细胞再生可能是包括血管紧张素抑制剂在内的一些药物减少肾小球硬化的重要机制［4-5，16］。本研究在人肾脏组织中成功分离出干细胞标记分子CD24 和CD133 呈阳性的CD24+CD133+PEC，且具有增殖能力。

WT1 维持足细胞的分化状态及其完整性，也是足细胞特异性标记分子［17］。在本研究中，我们将CD24+CD133+PEC在VRAD 分化培养液中诱导分化，结果显示WT1 在分化后的细胞中高表达，且在分化第2 天表达最高，结合细胞骨架蛋白染色，表明足细胞诱导分化成功。

Figure 3. WT1 expression during the differentiation of CD24+CD133+ PECs. A：Western blot showed that the expression of WT1 increased during the differentiation process of which increased significantly in the 2 day group；B and C：immunofluorescence staining showed that the expression of WT1 increased during the differentiation process of which increased significantly in the 2 day and 3 day groups and the highest in the 2 day group（scale bar=20 μm）；D：RT-qPCR showed that the expression of WT1 increased during the differentiation process of which increased significantly in the 2 day and 3 day groups and the highest in the 2 day group. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CD24+CD133+PEC group.图3 CD24+CD33+PEC分化过程中WT1表达水平

C3aR 是补体C3 裂解产物C3a 的受体，近年来的研究表明，C3aR 表达于多种器官的固有细胞中，表现出多种多样的非免疫功能。特别是其在系统发育、细胞分化、增殖和凋亡中均起作用［7，18-20］。有研究显示，破骨细胞分泌C3a，通过C3aR 作用于成骨细胞，促进其分化［21］。C3a 刺激肝细胞增殖，逆转肝细胞脂肪降解，增强肝功能［22］。此外在肾脏中，显示抑制C3aR 可减轻糖尿病肾病患者肾小球纤维化［8］；在IgA 肾病中，阻断C3aR 或C5aR 可以减少模型小鼠的蛋白尿和减轻肾组织损伤［9］；白藜芦醇通过抑制C3aR减轻局灶节段性肾小球硬化［11］。然而，C3aR在CD24+CD133+PEC 向足细胞分化过程中的作用未明。我们的研究结果显示，在CD24+CD133+PEC 向足细胞分化过程中，C3aR 表达降低。进而，构建C3a分泌性表达慢病毒转染CD24+CD133+PEC 并诱导其分化，结果提示C3a 过表达组细胞活力显著增强、WT1表达显著降低，上皮细胞标记物E-cadherin表达显著升高，提示C3a 过表达促进了CD24+CD133+PEC的增殖能力并且抑制了CD24+CD133+PEC 的分化能力。

Figure 4. Cytoskeleton staining showed that after the CD24+ CD133+ PECs differentiation for 1，2 and 3 days，the cells enlarged with pseudopods protruding. Scale bar=20 μm.图4 细胞骨架染色

Figure 5. C3aR expression during the differentiation of CD24+CD133+PECs. A：Western blot showed that the expression of C3aR decreased significantly during the differentiation process；B and C：immunofluorescence staining showed that the expression of C3aR decreased significantly during the differentiation process（scale bar=20 μm）；D：RT-qPCR showed that the expression of C3aR decreased significantly during the differentiation process. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CD24+CD133+PEC group.图5 CD24+CD133+PEC分化过程中C3aR表达水平

Figure 6. Fluorescence staining showed strong fluorescence in CD24+CD133+PEC in both NC group and C3a overexpression group after lentivirus infection. Scale bar=100 μm.图6 荧光染色显示慢病毒转染CD24+CD133+PEC后NC组与C3a过表达组均有较强荧光

Figure 7. C3a expression in CD24+CD133+PECs after lentivirus infection. A：RT-qPCR showed that the expression of C3a was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+PEC group and NC group；B：ELISA showed that the secretion of C3a was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group.图7 慢病毒转染CD24+CD133+PEC后C3a的表达水平

ERK1/2 广泛存在且功能多样，其调控细胞周期进展、细胞增殖、分裂、转录、分化、衰老、死亡、迁移、突起延伸和黏附［23］。激活的ERK1/2 可以将细胞外刺激转化为控制基因表达的细胞内信号，从而调控细胞增殖和分化［24］。Eng等［25］证实ERK1/2通路活化是影响CD24+CD133+PEC 向足分化的重要因素，然而C3aR是否通过该通路起作用仍未可知。我们的研究结果显示C3a 过表达组p-ERK1/2 表达显著升高，结合WT1和E-cadherin的表达水平，提示C3a过表达可能通过激活ERK1/2通路抑制了CD24+CD133+PEC向足细胞分化。

综上所述，C3aR 调控了 CD24+CD133+PEC 向足细胞的分化且可能通过ERK1/2 通路起作用。为足细胞损伤后修复提供了新思路，其具体的机制还有待进一步研究。

Figure 8. Viabiltiy and differentiation capability of CD24+CD133+PECs after lentivirus infection. A：CCK-8 showed that the proliferation capability was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group；B，C and D：Western blot showed that the expression of WT1 was significantly lower in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group，while the expression of E-cadherin was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group after differentiation for 2 days. Mean±SD. n=3.**P＜0.05 vs NC group.图8 慢病毒转染CD24+CD133+PEC后的细胞活力和分化水平

Figure 9. Western blot showed that the expression of p-ERK1/2 was significantly higher in C3a overexpression group than that in CD24+CD133+ PEC group and NC group after lentivirus infection and differentiation for 2 days. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs NC group.图9 Western blot显示慢病毒转染壁层肾祖细胞并分化2 d后，C3a过表达组p-ERK1/2表达显著升高