孕期运动调节高血压大鼠子代血管平滑肌表型的Ppargc1α去甲基化机制*

陈 渝 ， 李珊珊 ， 张严焱 ， 刘晨喆 ， 李 丽 ， 石丽君 ，2△

（北京体育大学 1运动生理教研室，2运动与体质健康教育部重点实验室，北京100084；3重庆大学体育学院，重庆400044）

我国患心血管疾病人数达2.9 亿，病死率居首位，其中高血压占2.45亿，原发性高血压在高血压人群中的比例为90%～95%［1］。原发性高血压的流行病学和临床特征表明，同卵双生子代在高血压发生和发展阶段存在不完全一致的现象［2］，表明表观遗传因素可能与高血压有关。表观遗传受环境影响，能够经细胞分裂保留并持续存在［3］。DNA 甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，能够抑制基因的表达［4］，DNA 去甲基化有利于基因的表达［5］。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是构成血管壁的主体，是一种非终末分化细胞，易受异常环境的刺激，具有表型分化的能力［6］。病理条件时，VSMC可由高度分化的收缩表型向去分化的合成表型转换［7］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC1α）可与多个因子结合参与调节VSMC的表型转换，抑制VSMC由收缩表型向合成表型转换［8-9］。孕期运动能够增加子代血管平滑肌舒张功能［10］。孕期运动对高血压子代血管是否也会产生这种影响，该影响是否与血管平滑肌表型改变有关，且这种改变是否受Ppargc1α基因（编码PGC1α）去甲基化调控，目前尚未清楚。因此，本研究选用自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR；一种常用的基因型高血压动物模型）及其正常血压对照Wistar-Kyoto（WKY）大鼠为研究对象，探讨孕期运动对高血压大鼠子代血管结构的影响及其表观遗传学机制，以期为孕期运动的推广及运动处方的制定提供实验依据。

材料和方法

1 动物分组及运动方案

选用SPF 级SHR 及其对照WKY 品系大鼠，各品系采用12周龄雄性和11周龄雌性进行配种，配种大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016-0006。雌雄大鼠按1∶1 合笼配种，以见栓且阴道涂片见精子定为妊娠第1 天（gestation day 1，GD1），配种成功后取出雄鼠［11］。将孕鼠随机分为孕期运动（p-WKY-EX 和p-SHR-EX）组和孕期安静（p-WKY-SED 和p-SHR-SED）组，每组各25 只，饲养于北京体育大学动物房，饲养房湿度45%～55%，温度22～24 ℃，12/12 h昼夜光照循环。每只孕鼠分笼饲养，选用国家标准啮齿类动物繁殖专用饲料。本研究所有动物实验均经北京体育大学伦理委员会批准。

孕期运动方案参照Volpato 等［12］研究，雌鼠在一周适应性饲养后，配种前5 d 进行水环境适应，水深10 cm，水温34～35 ℃，每天适应15 min。配种成功后，运动组进行游泳训练，前4 d为适应性训练，水深40 cm，训练时间从20 min 开始，每天递增10 min，从第5 天开始，每天运动60 min，每周运动6 天，直至GD19。为避免水环境对孕鼠产生影响，安静组在运动组运动期间置于水深10 cm 的相同水环境中。训练结束后用水冲洗大鼠，并及时吹干大鼠毛发。每天游泳训练前监测孕鼠体重和进食量，一部分孕鼠在GD21时，异氟烷麻醉并人道处死，剖腹取胎鼠，取雄性作为研究对象，监测胎盘重量和胎鼠质量；另一部分孕鼠分娩后，雄性子代母乳喂养21 d，然后按母鼠编号分笼并饲养到3月龄，每笼不超过3只。

2 主要试剂及仪器

兔抗骨桥蛋白（ostepontin，OPN）单克隆及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和平滑肌肌球蛋白重链（smooth muscle moyosin heavy chain，SM-MHC）多克隆抗体（Abcam）；TET2 多克隆抗体、Maxima First Strand DNA Synthesis Kit、TaqMan Gene Expression Master Mix、Ppargc1α基因TaqMan探针（Rn00580241_m1，扩增长度94 bp）和Actb基因（编码β-actin）TaqMan 探针（Rn00667869_m1，扩增长度91 bp）均购自Thermo Fisher；β-actin和β-tubulin单克隆抗体（CST）；EZ DNA Methylation-Gold Kit 和Quest 5-hmC™ DNA ELISA Kit（ZYMO Research）；TIANgel Midi Purification Kit（Tiangen）。酶标仪和转膜系统（Bio-Rad）；血压监测仪（Kent Scientific）。

3 主要方法

3.1 HE 染色 异氟烷麻醉后，断头处死大鼠。取子代3 月龄大鼠肠系膜动脉，将周围脂肪组织小心剥离干净，放入4%组织细胞固定液中4 ℃固定24 h，流水冲洗，常规石蜡包埋，5 μm 切片。HE 染色观察血管结构变化，显微镜观察并拍照，Image-Pro Plus软件统计血管内径与中膜厚度。

3.2 Western blot 将肠系膜动脉放入提前预冷含研磨珠的离心管中，按每10 mg 组织加入60 μL 配制裂解液，放入快速组织细胞破碎仪中，4 ℃匀浆。待组织裂解完全后，吸取匀浆液放入新的离心管中，4 ℃、13 400×g离心30 min，取上清液BCA 法检测蛋白浓度。制备SDS-PAGE 样品，上样量为20 μg。电泳后，蛋白转移至PVDF 膜，5% BSA 封闭，放入Ⅰ抗（β-actin，1∶9 000；β-tubulin，1∶8 000；α-SMA，1∶600；OPN，1∶1 000；SM-MHC，1∶1 200；TET2，1∶500）中4 ℃孵育过夜。次日TBST 清洗，室温孵育Ⅱ抗后，凝胶成像系统发光成像。β-actin 或β-tubulin作为内参照，采用ImageJ 软件对目的条带和内参照条带灰度值进行分析。

3.3 RT-qPCR 从肠系膜动脉平滑肌提取RNA，采用Maxima First Strand DNA Synthesis Kit 反转录成cDNA，TaqMan Gene Expression Master Mix 进行扩增反应，扩增条件为 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，之后扩增40 个循环（95 ℃ 15 s、60℃ 60 s）。目的基因表达采用2-ΔΔCt法进行相对定量［13］。

3.4 亚硫酸氢盐测序法 提取肠系膜动脉基因组DNA，采用 EZ DNA Methylation-Gold Kit 对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。随后在Ppargc1α基因启动子区CpG 岛外围（不含CpG 位点）进行PCR 扩增，产物经2%琼脂糖检测，切胶，使用TIANgel Midi Purification Kit 对 DNA 回收纯化；之后将 PCR 产物克隆至载体后，挑取10 个克隆进行测序。对Ppargc1α基因启动子-833～-190 总共643 bp 进行甲基化测定，由于检测序列过长，因此共设计了2 个反应进行甲基化的测定。Ppargc1α基因引物：5′-TAGTTAATTTGTTTTAGGGTTGGT-3′，5′-ACCCAAACTCAACTTAAAACTAA-3′；5′-AAAGAAAAAAGGGGGATTYGTTG-3′，5′-CAACTTTAAATACCACCAACTCTA-3′。甲基化结果以甲基化百分比表示：甲基化CpG/（甲基化CpG+未甲基化CpG）×100%。

3.5 5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）测定 提取肠系膜动脉基因组DNA，按照Quest 5-hmC™DNA ELISA Kit操作进行，酶标仪检测吸光度，根据拟合曲线，计算5hmC百分比。

4 统计学处理

用SPSS 17.0 统计软件进行分析。所有数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。多组间比较采用双因素方差分析（two-way ANOVA，高血压×运动）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 孕期运动显著增加高血压孕鼠胎盘效率

孕鼠进食量以取出雄鼠后次日（GD2）开始监测，体重增长情况从配种成功后第1天（GD1）开始计算。如图1A、B 所示，各组孕鼠孕期总进食量和总体重增长量无显著差异（P＞0.05）。

如图1C、D 所示，高血压子代胎鼠（p-SHR-SED）体重与p-WKY-SED 组相比显著下降（P＜0.01），而胎盘重量则显著增加（P＜0.05），孕期运动显著增加高血压子代胎鼠体重（P＜0.01），单对胎盘重量无影响（P＞0.05）。胎盘效率=胎鼠重量/胎盘重量，反映了子宫空间效应与营养供应能力对胎儿的影响。如图1E 所示，p-SHR-SED 组胎盘效率与 p-WKY-SED 组相比显著降低（P＜0.01），p-SHR-EX 组胎盘效率与p-SHR-SED组相比显著升高（P＜0.05）。

2 孕期运动降低高血压子代大鼠血压

p-SHR-SED 组 SBP、DBP 和 MAP 均显著高于 p-WKY-SED 组（P＜0.01），而 p-SHR-EX 组 DBP 和 MAP与p-SHR-SED 组相比均显著降低（P＜0.05）；p-SHRSED 组 HR 显著高于 p-WKY-SED 组（P＜0.01），而孕期运动对正常血压子代（p-WKY-EX）和高血压子代（p-SHR-EX）HR均无显著影响（P＞0.05），见图2。

3 孕期运动抑制高血压子代大鼠肠系膜动脉血管平滑肌由收缩表型向合成表型转换

如图 3A～D 所示，p-SHR-SED 组与 p-WKY-SED组相比血管内径显著缩小（P＜0.01），血管中膜厚度及中膜厚度与内径比值均显著增加（P＜0.01）；与p-SHR-SED 组相比，p-SHR-EX 组血管内径显著增大（P＜0.05），血管中膜厚度及中膜厚度与内径比值均显著减小（P＜0.01）。

Figure 1. Food intake（A）and weight gain（B）of pregnant rats，and placental efficiency of male fetuses（C，D and E）. Food intake of pregnant rats was calculated from GD2 for 6 d in the first week，and 7 d in the following two weeks. Mean±SEM. n=15 in each group from pregnant rats（A and B）；n=46 in p-WKY-SED，n=39 in p-WKY-EX，n=40 in p-SHR-SED，and n=38 in p-SHR-EX from 8 pregnant rats（C，D and E）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs p-SHRSED group.图1 孕鼠进食量和体重增长量及雄性胎鼠胎盘效率

Figure 2. Blood pressure and heart rate（HR）of the offspring. SBP：systolic blood pressure；DBP：diastolic blood pressure；MAP：mean arterial pressure. Mean±SEM. n=11.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED；#P＜0.05 vs p-SHR-SED.图2 子代大鼠血压和心率

为明确血管形态的变化是否与表型标志蛋白有关，采用Western blot 检测各组子代肠系膜动脉血管平滑肌表型标志蛋白的表达。结果显示，p-SHRSED 组收缩表型标志蛋白α-SMA 和SM-MHC 的表达与p-WKY-SED 组相比均显著降低（P＜0.05），合成表型标志蛋白 OPN 则显著升高（P＜0.05）；与p-SHRSED 组相比，p-SHR-EX 组 α-SMA 和 SM-MHC 蛋白表达均显著增加，OPN蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图3E。

Figure 3. Morphological changes and phenotypic marker proteins of mesenteric arteries from the offspring. A：representative images showing HE staining of the mesenteric artery in the offspring of 4 groups（scale bar=50 μm）；B：lumen diameter；C：medial layer thickness；D：the ratio of medial layer thickness to lumen diameter；E：the protein expression levels of α-SMA，SM-MHC and OPN in mesenteric arteries. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs p-SHR-SED group.图3 子代大鼠肠系膜动脉形态和表型标志蛋白表达

4 孕期运动抑制高血压子代肠系膜动脉Ppargc1α基因高甲基化

首先，我们对子代大鼠肠系膜动脉PGC1α 蛋白表达进行检测，如图4A 所示，与p-WKY-SED 组相比，p-SHR-SED 组 PGC1α 蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与p-SHR-SED组相比，p-SHR-EX组PGC1α表达显著增加（P＜0.05）。为进一步明确PGC1α 蛋白表达的变化是否受转录水平的影响，我们对子代大鼠肠系膜动脉PGC1α mRNA 进行检测，如图4B 所示，各组mRNA 水平与蛋白表达趋势一致。然后，对Ppargc1α基因启动子区甲基化进行检测，结果如图4C～F 所示，各组Ppargc1α基因整体甲基化水平无显著差异（P＞0.05）；对影响Ppargc1α基因转录的-219 bp CpG 位点甲基化水平进行分析显示，p-SHR-SED组与p-WKY-SED 组相比，该位点甲基化水平显著增加（P＜0.05）；p-SHR-EX 组与p-SHR-SED 组相比，该位点甲基化水平显著降低（P＜0.05）。

5 孕期运动增加高血压子代肠系膜动脉TET2 蛋白表达与5hmC水平

对各组子代大鼠肠系膜动脉TET2 蛋白表达进行检测，如图 5A 所示，p-SHR-SED 组 TET2 蛋白表达显著低于p-WKY-SED 组（P＜0.05）；与p-SHR-SED 组相比，p-SHR-EX 组 TET2 蛋白表达显著上调（P＜0.05）。接着，提取肠系膜动脉DNA，检测与去甲基化密切相关的5hmC含量，观察孕期运动是否改变子代去甲基化，如图 5B 所示，p-SHR-SED 组 5hmC 百分比显著低于p-WKY-SED 组（P＜0.01），p-SHR-EX 组5hmC百分比显著高于p-SHR-SED组（P＜0.05）。

讨 论

Barker 学说认为，发育早期的不良环境因素可能导致胎儿生理机能发生永久性改变，增加日后患病的风险［14］。原发性高血压受遗传和环境因素共同调控。运动作为一种重要的非药物干预手段，对高血压防治有着积极作用。而高血压孕期能否进行运动，以及孕期运动对子代产生何种影响，目前尚未可知。本研究通过建立高血压大鼠孕期运动模型，探讨了孕期运动是否改善子代大鼠成年后血管重构与表型转换，以及可能参与的表观遗传机制。研究表明孕期运动可通过增加3月龄子代大鼠TET2蛋白表达，增加Ppargc1α基因启动子-219 bp CpG 位点去甲基化，调控PGC1α蛋白表达，抑制血管平滑肌由收缩表型向合成表型转换（图6）。

出生体重是宫内环境和孕妇与新生儿健康的重要评价指标。流行病学研究表明出生时低体重和增加的胎盘重量增加了成年患高血压的风险［15］。本研究检测到高血压大鼠子代胎儿体重较正常血压对照组显著降低，胎盘重量则显著增加，这与Johnston等［16］的研究结果一致。胎盘效率被认为是胎儿生长的替代物，虽然胎盘效率由基因决定，但环境的变化也会改变胎盘效率［17］。本研究显示，孕期运动增加了高血压大鼠子代胎盘效率，故推测孕期运动能够改善子宫环境，对胎儿健康具有积极影响。运动的这种影响可能与胎盘血流量增加、氧气和营养转运效率增加有关。

SHR 是人类原发性高血压常用的动物研究模型。对SHR 和WKY 大鼠之间单细胞胚胎的相互交换表明，SHR 宫内环境显著增加WKY 基因型子代120 d 时的血压，WKY 宫内环境显著降低同龄SHR基因型子代的血压，表明子宫环境决定了WKY/SHR基因型在后期发生高血压的敏感性［18］。在本研究中，孕期运动降低了SHR 子代DBP 和MAP，提示孕期运动可以通过改善宫内环境降低高血压大鼠子代成年后血压。高血压期间，阻力动脉尤其容易发生血管重构，血管平滑肌出现部分收缩表型向合成表型转换［19］。我们对各组子代大鼠肠系膜动脉血管形态和平滑肌表型标志蛋白表达的检测结果也表明，高血压大鼠子代血管管径减小，管壁增厚，VSMC 发生表型转换，孕期运动能够有效抑制高血压子代VSMC表型转换，避免血管形态重构。

在心血管疾病中PGC1α 主要参与VSMC 增殖和衰老。PGC1α 的失活可导致VSMC 肥大和衰老，而激活 PGC1α 可缓解 VSMC 的这种变化［20］。高血压时，血管平滑肌细胞PGC1α 蛋白表达下调［21］。多项研究证实表观遗传学变化可在生理和病理环境中控制PGC1α 的基因表达［22-24］。为探讨孕期运动是否对高血压子代Ppargc1α基因去甲基化产生影响，我们首先对PGC1α蛋白进行检测，结果显示，孕期运动显著增加高血压子代 PGC1α 蛋白表达，且 PGC1α 蛋白表达的差异受转录水平影响。接着，我们对Ppargc1α基因的甲基化水平进行检测，明确PGC1α转录水平的变化是否受表观遗传调控。Ppargc1α基因甲基化在人和小鼠均有研究，且Ppargc1α基因在启动子区-260 bp CpG 位点附近的碱基序列在人、小鼠和大鼠的基因上是相同的，在此位点发生的DNA甲基化会抑制PGC1α 表达［24-25］。我们根据文献提供的碱基序列查询大鼠Ppargc1α基因序列显示，人类-260 bp CpG 位点在大鼠DNA 序列中位于启动子区-219 bp 的位置。因此，我们主要对Ppargc1α基因-219 bp CpG 位点附近的序列进行甲基化检测。结果表明孕期运动显著抑制了高血压子代大鼠Ppargc1α基因该位点的高甲基化。TET 家族是参与DNA 去甲基化的关键酶，催化5mC 形成5hmC，导致DNA 去甲基化，增加基因表达［26］。我们对肠系膜动脉去甲基化相关指标的检测结果表明，高血压子代大鼠TET2 蛋白和5hmC 水平均显著下降，而孕期运动增加二者水平。这提示，高血压时大鼠肠系膜动脉DNA 去甲基化水平下降，减少PGC1α 表达，而孕期运动增加子代肠系膜动脉去甲基化水平，增加PGC1α表达。

Figure 4. Methylation level of Ppargc1α gene in the mesenteric artery from the offspring. A：the protein expression level of PGC1α；B：the transcription level of PGC1α；C：CpG sites in promoter region of Ppargc1α gene；D：representative DNA methylation status of the CpG sites of Ppargc1α gene（the solid circles represent methylated cytosines，and hollow circles denote unmethylated ones；7 CpG sites of the Ppargc1α gene and 10 clones were subjected to sequencing）；E：the percentage of methylation levels of all measured CpG sites within Ppargc1α gene；F：the methylation level of -219 bp CpG site. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs p-WKY-SED；#P＜0.05 vs p-SHR-SED.图4 子代大鼠肠系膜动脉Ppargc1α基因甲基化水平

Figure 5. The levels of TET2 protein and 5hmC in ther mesenteric artery of the offspring. A：relative protein expression level of TET2 in each group；B：the level of 5hmC in each group. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED；#P＜0.05 vs p-SHR-SED.图5 子代大鼠肠系膜动脉TET2表达与5hmC水平

Figure 6. Epigenetic mechanism of gestational exercise in regulating vascular remodeling in hypertensive offspring.图6 孕期运动调节高血压子代血管重构的表观遗传机制图

综上所述，孕期运动可通过增加TET2 介导的Ppargc1α基因启动子区去甲基化，抑制高血压大鼠子代成年后血管平滑肌由收缩表型向合成表型转换，缓解其血管重构。