激活α7 nAChR通过抑制慢性炎症反应减轻饮食诱导的大鼠肥胖型高血压*

马度芳， 蔡 璐， 姜 萍， 李 晓， 王 咏△

（1山东中医药大学附属医院，山东济南250014；2山东中医药大学，山东济南250014）

肥胖型高血压的发生涉及多种病理机制，包括胰岛素和瘦素抵抗、脂肪组织炎症、过度的交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活等［1］。其中，代谢异常导致的中枢和外周组织中慢性低度炎症反应状态，引发交感神经过度激活，是肥胖型高血压的重要病理机制之一［2］，也是目前开发新药物的潜在作用途径。

在肥胖早期，过多的营养物质，如葡萄糖、游离脂肪酸和氨基酸等可通过脑脊液渗入到下丘脑中，诱导下丘脑中的炎症反应［3-4］。随着肥胖的发生，外周组织中产生的促炎因子可反馈到大脑中，强化和维持下丘脑原有的炎症反应［5］。下丘脑内侧基底部是调节食欲、血压和能量代谢的重要区域，该处IκB激酶 β/核因子 κB（IκB kinase β/nuclear factor-κB，IKKβ/NF-κB）促炎通路激活导致的慢性炎症反应是诱导肥胖型高血压的重要机制［6］。激活的促炎通路可诱导瘦素信号负性调节因子，如细胞因子信号转导 抑 制因 子 3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）和蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphotase 1B，PTP1B）的产生，两者可阻断瘦素在下丘脑中的传导信号——Janus 激酶2/信号转导及转录激活因子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）信号通路，导致瘦素抵抗［7］。在这种条件下，瘦素不能有效调节能量稳态，却可通过激活磷酯酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路而激活交感神经，导致交感神经兴奋释放过多去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）而介导高血压［8］。由此可见，下丘脑中瘦素抵抗可归因于下丘脑内侧基底部的促炎通路激活。抑制中枢炎症反应可恢复下丘脑的瘦素信号敏感性，起到对抗肥胖和肥胖型高血压的作用。

α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChR）参与的胆碱能抗炎通路在抵抗机体炎症反应中起到重要作用，该抗炎途径由迷走神经、神经突触释放的乙酰胆碱及分布在细胞表面的α7 nAChR 组成。当迷走神经兴奋时可释放乙酰胆碱，后者与免疫细胞表面的α7 nAChR 结合后可抑制 IKKβ/NF-κB 通路而减少白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子的产生，抑制炎症反应［9］。研究已发现在下丘脑神经元和外周脂肪组织中存在大量的α7 nAChR［10］。给予尼古丁激活α7 nAChR 可减轻大鼠瘦素抵抗和胰岛素抵抗［11］，提示激活α7 nAChR 减轻机体炎症反应是治疗肥胖及其并发症的潜在作用靶点。据此，我们推断对于肥胖型高血压，激活中枢和外周α7 nAChR 可能减轻机体炎症反应和中枢瘦素抵抗，从而阻止肥胖型高血压的发生。

材料和方法

1 实验动物

8 周龄 SPF 级雄性 Wistar 大鼠 45 只，体重（200±20）g，购于山东济宁鲁抗动物药业有限公司，许可证号为SCXK（鲁）2013-0001。大鼠饲养环境温度为（22±2）℃，明暗时间为12 h/12 h，可自由饮水摄食。

2 实验材料

α7 nAChR 拮抗剂 α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT；Cat No.ab120542，Abcam）；α7 nAChR激动剂PUN-282987（Cat No.2303，Tocris Bioscience）；大鼠瘦素ELISA 试剂盒（Cat No. 10638R）和大鼠NE ELISA 试剂盒（Cat No. 10171R）购自Assay Biotech；大鼠IL-1β ELISA 试剂盒（Cat No. ab100768）、大鼠TNF-α ELISA 试剂盒（Cat No.ab46070）、兔单克隆p-STAT3 抗体（Cat No.ab76315）、兔多克隆p-PI3K p85抗体（Cat No. ab182651）、兔多克隆α7 nAChR 抗体（Cat No. ab10096）、兔多克隆 p-IKKβ 抗体（Cat No.ab59195）和兔多克隆TNF-α 抗体（Cat No.ab6617）购自Abcam；兔多克隆p-NF-κB p65 抗体（Cat No.1075-1-ap，Proteintech）；小鼠多克隆IL-1β 抗体（Cat No.sc-1265，Santa Cruz Biotechnology）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）Ⅱ抗（Cat No.ZB2305）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）Ⅱ抗（Cat No.ZB2305）购自Zsbio。

3 实验仪器

ELx50 型洗板机（BioTek）；ST8 型低速自动平衡离心机和 MultiskanGo 酶标仪（Thermo Scientific）；Axiovert 40 型倒置相差显微镜和ZEN 1.01.0 图像分析软件（Carl Zeiss AG）；LightCycler®480 实时荧光定量PCR 系统（Roche）；Mini-PROTEAN 垂直电泳仪和小型 Trans-Blot 转印槽（Bio-Rad）；FluorChem Q 蛋白印迹成像和定量分析系统（Alpha）。

4 方法

4.1 动物分组及干预 动物适应1 周后，分为空白对照组（NF con 组，n=8）和肥胖模型组（n=37）。肥胖模型组给予高脂饮食饲养诱导肥胖动物模型，NF con 组给予普通饲料喂养。16 周后，体重、血压较空白对照组大鼠平均值升高25%的高脂饮食大鼠即为肥胖动物［12］。将诱导的肥胖动物32 只随机分为3组：模型对照组（HF con 组，n=10）、激动剂组（PNU组，n=10）和抑制剂组（α-BGT+PNU 组，n=12）。PNU组给予每日腹腔注射 PNU-282987（3 mg/kg［13］）；α-BGT+PNU 组每日腹腔注射 α-BGT（1 μg/kg［14］）和PNU-282987（3 mg/kg），且 α-BGT 均在给予 PNU 前30～40 min 给药，与 PNU-282987 的给药时程相同；NF con组和HF con组腹腔注射生理盐水（1 mL）。共持续注射6 周。实验所涉及的大鼠操作均得到山东中医药大学附属医院动物伦理委员会的审批。

4.2 监测血压、进食量和体重 每周一上午测量各组大鼠体重。每周一分别测量各只大鼠24 h进食量一次，作为一周的每天进食量。每周周三～周五的上午7 点～11 点使用尾动脉加压法测量各只大鼠清醒状态下的收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP）和心率，连续测量至少3次，取3次平均值，每次测量间隔3 min。

4.3 动物处死和留取标本 于22 周后，大鼠禁食10 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉。腹腔抽取腹下腔静脉血10～15 mL，静置离心后取上清待测。体循环生理盐水灌注后取下丘脑组织，参照De Groot 等［15］大鼠脑图谱，剥离下丘脑内侧基底部。分离出附睾脂肪，腹膜后脂肪和肾周脂肪并称量，作为内脏脂肪总重。计算内脏脂肪总重与体重的比值。留取附睾脂肪和右侧肾脏组织，待测。

4.4 HE 染色 取附睾脂肪组织固定后制作石蜡块，切片后行HE 染色，进行镜下分析，每组随机取4～7个标本，每个标本取2个切片，每个切片取2～3个视野来统计脂肪细胞大小。

4.5 ELISA 检测血浆和肾脏中NE 和瘦素水平 取出保存的血浆2 mL样品，离心（15 000×g）后，检测血浆中NE 和瘦素水平。取肾脏组织匀浆后取上清液，检测上清液中NE 水平。取严格按照ELISA 试剂盒说明操作。

4.6 RT-qPCR 检测下丘脑组织 LepRb、SOCS3 和PTP1B 的mRNA 表达水平 将下丘脑组织标本离心后，按说明书操作步骤，用Trizol 法提取组织内总RNA 并测定总RNA 浓度和纯度。按PrimeScript RT逆转录试剂盒说明书合成cDNA，通过LightCycler®480 实时荧光定量PCR 系统进行检测，以GAPDH 为内参照，数据采用 2-ΔΔCt法进行分析。LepRb 的上游引物序列为 5′-GAGAGGCTGCTGAAATCGTC-3′，下游引物序 列为 5′-GACTCCTGAGCCATCCAGTC-3′；SOCS3 的上游引物序列为 5′-CTTTACCACCGACGGAACCT-3′，下游引物序列为 5′-GAACTCCCGAATGGGTCCAG-3′；PTP1B 的上游引物序列为 5′-TTTCCACTACACCACCTGGC-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CACTGATCCTGCACTGACGA-3′；GAPDH 的上游引物序列为 5′-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′，下游引物序列为5′-AAGGTGGAGAATGGGAGTT-3′。

4.7 Western blot 检测下丘脑组织p-STAT3、p-PI3K、p-IKKβ、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 蛋白水平 提取下丘脑组织蛋白，BCA 检测试剂盒检测蛋白浓度，5%分离胶分离后，250 mA 转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入Ⅰ抗（p-STAT3，1∶150 000；p-PI3K、NF-κB 和 IL-1β，1∶500；p-IKKβ，1∶1 000；TNF-α，1∶150）。4 ℃孵育过夜后洗涤，加入Ⅱ抗，孵育后洗膜，ECL 发光检测，采用IPP 6.0 软件对图像进行扫描定量，计算各组蛋白表达的灰度值与内参灰度值的比值作为蛋白表达的相对含量。每个样本的每个指标重复做3次，最后取其均值。

5 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析；数据以均数±标准差（mean±SD）表示。定量资料经Shapiro-Wilk 检验做正态分布检验，将不符合正态分布的数据转换为其相应的自然对数以近似正态分布，经方差齐性检验后采用方差分析进行组间比较，组间两两比较采用Dunnett 检验或SNK-q检验；若经转化后仍不符合正态分布，则选用Kruskal-Wallis 秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 激活α7 nAChR可阻止体重增加，减少脂肪堆积

各组大鼠给药结束后，PNU 组死亡2只，α-BGT+PNU 组死亡 4 只，去掉死亡大鼠，最终 HF con 组、PNU 组和α-BGT+PNU 组纳入实验的数量各为8 只，NF con组为10只。

与NF con组比较，HF con组大鼠体重持续升高，在第6 周较NF con 组增加了44%［（603.4±58.1）gvs（419.0±36.0）g］；给予 α7 nAChR 激动剂 PNU-282987 治疗6 周可显著减轻高脂饲养大鼠体重，并降低进食量（P＜0.05 或P＜0.01），见图1A、B。此外，与NF con 组大鼠相比，HF con 组大鼠内脏脂肪重量和脂肪总重/体重增加（P＜0.01）；相比HF con 组，给予PNU-282987 后的PNU 组大鼠内脏脂肪重量和脂肪总重/体重降低（P＜0.01）；然而，同时给予 α7 nAChR 拮抗剂 α-BGT 可抵消 PNU-282987 的上述作用（P＜0.01），见图1C、D。

Figure 1. The body weight（A），daily food intake（B），fat weight（C）and fat weight/body weight（D）in each group. W：week（s）.Mean±SD. n=8 in NF con group，PNU group and α-BGT+PNU group；n=10 in HF con group.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HF con group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs PNU group.图1 各组大鼠的体重、每日进食量、脂肪总重和脂肪总重/体重

2 激活α7 nAChR可抑制脂肪细胞体积增大

如图2 所示，HF con 组的脂肪细胞表面积显著大于 NF con 组［（11 034±619）pixel2vs（4 329±225）pixel2，P＜0.01］；而PNU组的脂肪细胞表面积显著小于 HF con 组［（7 005±1 019）pixel2vs（11 034±619）pixel2，P＜0.01］和 α -BGT+PNU 组［（7 005±1 019）pixel2vs（11 292±793）pixel2，P＜0.01］；HF con 组与α-BGT+PNU组比较无显著差异。

3 激活α7 nAChR可减轻肥胖诱导的高血压

HF con 组 大 鼠的 SBP 和 DBP 均高于 NF con 组（P＜0.01），在第 6 周 SBP 和 DBP 分别增加了 11%［（127.7±5.5）mmHgvs（141.8±5.4） mmHg，P＜0.01］和 17%［（108.0±2.6）mmHgvs（126.4±4.2）mmHg，P＜0.01］；给予PNU-282987 治疗的大鼠SBP和DBP 在第2～6周均较HF con组降低（P＜0.05或P＜0.01）；而且，PNU 组大鼠的 SBP 在第 3～6 周也低于α-BGT+PNU 组（P＜0.01），DBP 在第 5 和 6 周时低于α-BGT+PNU组（P＜0.01），见图3A、B。

Figure 2. HE staining of adipose tissues（scale bar=200 μm）and determination of adipocyte surface area. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs NF con group；##P＜0.01 vs HF con group；△△P＜0.05 vs PNU group.图2 脂肪组织HE染色和脂肪细胞表面积

为了评估外周交感神经活性，我们检测外周血和肾脏组织中NE含量，结果显示HF con组大鼠肾脏中的 NE 含量均高于 NF con 组（P＜0.01）；PNU 组的肾脏中NE 含量低于HF con 组和α-BGT+PNU 组（P＜0.01），见图3C。各组血液中NE 含量差异无统计学意义，见图3D。

Figure 3. The blood pressure（A and B；n=8 in NF con group，PNU group and α-BGT+PNU group；n=10 in HF con group），and renal tissue（C；n=8）and blood（D；n=6）levels of NE in each group. Mean±SD.**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HF con group；△△P＜0.01 vs PNU group.图3 各组大鼠血压及肾脏组织和血液中NE水平

4 激活α7 nAChR抑制下丘脑中的炎症反应

给予高脂饲养可增强下丘脑中的炎症反应，HF con 组下丘脑组织中 p-IKKβ（P＜0.01）、NF-κB（P＜0.05）以及促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表达增加（P＜0.05）；给予 PNU-282987 可抑制下丘脑中 p-IKKβ、NF-κB、IL-1β 和 TNF-α（P＜0.05）；同 时 给 予 α7 nAChR 拮抗剂 α-BGT 可使 p-IKKβ、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 表达较PNU 组增加（P＜0.05 或P＜0.01），减弱PNU-282987的作用，见图4。

5 激活α7 nAChR改善下丘脑瘦素敏感性

与NF con 组相比，HF con 组大鼠下丘脑中反映瘦素信号敏感的 p-STAT3 蛋白（P＜0.05）和 LepRb mRNA（P＜0.01）水平降低，而与瘦素抵抗有关的p-PI3K蛋白（P＜0.05）及瘦素信号负性调节因子SOCS3和PTP1B mRNA（P＜0.01）水平升高，且血浆中瘦素含量增加（P＜0.01）；与 HF con 组大鼠比较，给予PNU-282987 可增加 p-STAT3 蛋白水平（P＜0.05）和LepRb mRNA 水平（P＜0.01），并降低血浆中瘦素水平（P＜0.05），抑制下丘脑中p-PI3K 蛋白（P＜0.05）、SOCS3 mRNA（P＜0.01）和PTP1B mRNA（P＜0.05）水平；同时给予α7 nAChR 拮抗剂α-BGT 可减弱PNU-282987改善瘦素抵抗的作用，见图5。

Figure 4. The protein expression of p-IKKβ and NF-κB（A）and content of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α（B）in hypothalamus tissues. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05 vs HF con group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs PNU group.图4 下丘脑组织中p-IKKβ和NF-κB蛋白表达量及促炎因子IL-1β和TNF-α含量

讨 论

动物实验表明，长期营养过剩可增加中枢和外周中IKKβ/NF-κB 促炎信号介导的炎症反应，是导致肥胖型高血压的重要病理机制［6］。因此，抑制这种代谢性炎症反应成为治疗肥胖型高血压的重要途径。胆碱能抗炎通路的提出可从抗炎角度出发为防治肥胖及其相关并发症提供参考资料［16］。

已有研究证明，激活胆碱能抗炎通路可通过激活α7 nAChR 而抑制IKKβ/NF-κB 促炎通路，减少炎症反应［9］。本研究结果显示高脂饮食诱导的肥胖大鼠的下丘脑p-IKKβ、NF-κB及IL-1β和TNF-α蛋白水平升高，提示肥胖时中枢炎症反应增强。长期给予α 7 nAChR 激动剂 PNU-282987 治疗可抑制 p-IKKβ 和NF-κB 表达，减少中枢促炎因子的产生；而当同时给予 α7 nAChR 抑制剂 α-BGT 可减弱 PNU-282987 的上述抗炎作用消失，这表明α7 nAChR 在对抗肥胖导致的炎症反应中发挥重要作用，使用激动剂刺激α7 nAChR可抑制肥胖机体中枢炎症反应。

脂肪细胞产生的瘦素通过JAK2/STAT3 信号通路作用于下丘脑中瘦素受体而起到抑制食欲的作用［17］。与此同时，瘦素可通过激活交感神经而增加能量消耗［18］。长期慢性炎症可导致选择性瘦素抵抗，即过多的瘦素不能有效的抑制食欲和促进能量消耗，但却保留它对交感神经的兴奋作用，从而导致心率和血压升高［8］。肥胖时，机体内促炎通路IKKβ/NF-κB 激活可上调瘦素负性调节因SOCS3 和PTP1B的表达，后两者可打乱瘦素在下丘脑中的JAK2/STAT3 转导信号，诱导瘦素抵抗［19］。与 STAT3 信号通路相反，下丘脑中激活的PI3K 信号通路是导致交感神经兴奋的关键信号通路，而在瘦素介导的能量代谢中起到较小的作用［20］。当JAK2/STAT3 转导通路受到抑制时，过多的瘦素作用于下丘脑中的PI3K信号通路而引起交感神经兴奋，从而导致血压升高。因此，在肥胖中，炎症导致的STAT3信号转导降低和PI3K 信号通路增强是引起下丘脑瘦素抵抗，从而引起代谢紊乱和高血压发生的重要信号途径。本研究表明，高脂饮食诱导的肥胖导致血浆中瘦素水平升高，而下丘脑中LepRb mRNA 的表达降低；同时，下丘脑中 p-STAT3 降低而 p-PI3K 相对增加，SOCS3 和PTP1B 表达也增加。表明高脂饮食诱导的肥胖大鼠出现瘦素抵抗。给予PNU-282987 激活α7 nAChR 后抑制下丘脑中IKKβ/NF-κB 通路，可增加下丘脑中LepRb mRNA 和 p-STAT3 的 表 达 ，抑 制 p-PI3K 和SOCS3 mRNA 的表达，降低血浆中瘦素水平，表明给与α7 nAChR 激动剂PNU-282987 后可增加瘦素敏感性而改善瘦素抵抗。中枢瘦素敏感性的增加可降低中枢交感神经传出，从而减少外周NE 含量，阻止交感神经介导的血压升高。当同时给予α7 nAChR 抑制剂α-BGT 可减弱PNU-282987 的改善瘦素抵抗的作用，进一步提示激活α7 nAChR 可通过改善瘦素抵抗而抑制交感神经活性，降低血压。该结果为首次利用饮食诱导的肥胖大鼠模型，证明刺激α7 nAChR可通过抑制慢性炎症反应而改善瘦素抵抗介导的交感神经兴奋，从而抑制肥胖导致的血压升高。

Figure 5. The protein levels of p-STAT3 and p-PI3K（A），and the mRNA expression of LepRb，SOCS3 and PTP1B（B，D and E）in hypothalamus tissues，as well as the plasma level of leptin（C）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NF con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HF con group；△P＜0.05；△△P＜0.01 vs PNU group.图5 各组下丘脑组织中p-STAT3和p-PI3K蛋白水平及LepRb、SOCS3和PTP1B mRNA表达，以及血浆中瘦素含量

由于本实验需要长时间注射α7 nAChR 激动剂和抑制剂，操作难度较大，实验过程中未专门采取中枢特异性给药方式。因此，不能明确证明α7 nAChR激动剂的中枢直接抗炎作用。但从既往文献看，研究发现腹腔注射PNU-282987（3 mg/kg 或 6 mg/kg）可减少创伤性脑损伤导致的血脑屏障通透性，降低蛛网膜下出血导致的脑损伤以及中枢神经炎症反应［21］。表明全身给予PNU-282987可直接激活中枢α 7 nAChR 受体，减轻中枢性炎症反应，这支持我们的研究结果。

综上所述，在饮食诱导的肥胖大鼠中，使用激动剂刺激α7 nAChR 受体可抑制下丘脑中的慢性炎症反应，改善下丘脑瘦素抵抗，从而抑制中枢交感神经兴奋介导的血压升高，阻止肥胖型高血压的发生。