黄芪甲苷通过NRF2/HO-1信号通路减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤*

李泽华， 关贤颂， 蒋路平

（长沙市中心医院心血管内科，湖南长沙410004）

心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤是指心肌缺血后重新恢复血流灌注出现心肌损伤反而加重的现象［1］。随着经皮冠状动脉介入、溶栓治疗等技术的应用推广，心肌I/R 损伤逐渐成为临床面临的主要难题［2］。研究表明，氧化应激、钙超载和线粒体功能障碍等在心肌I/R 损伤中发挥重要作用［3-5］，其中氧化应激能激活促炎级联反应，导致心肌细胞凋亡，诱发心肌损伤［6］。因此，减轻心肌细胞氧化应激反应是减轻心肌I/R损伤的可能途径。

黄芪是豆科植物蒙古黄芪的干燥根，具有补气固表，托疮生肌之功效［7］，临床上常用于冠心病、高血压和糖尿病等疾病的辅助治疗［8］。研究表明，黄芪的主要有效成分黄芪甲苷（astragaloside IV，AST）能减少活性氧的释放，保护心肌细胞免受氧化应激损伤［9］。此外，黄芪甲苷还能抑制钙超载，减少心肌细胞凋亡，抑制心肌肥厚、心肌纤维化［10-11］，提示黄芪甲苷在心肌损伤中发挥重要的保护作用。但黄芪甲苷在心肌I/R 损伤中发挥的作用及机制尚不完全清楚。本研究首先采用C57BL/6 小鼠建立心肌I/R 损伤模型，在整体动物水平验证黄芪甲苷对小鼠的心肌保护作用；其次，采用过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）处理H9C2 细胞，在细胞水平研究黄芪甲苷通过NRF2/HO-1信号通路影响细胞损伤的分子机制。

材料和方法

1 实验动物和细胞

60 只 SPF 级 6～8 周龄 C57BL/6 雄性小鼠，18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物使用许可证号为SYXK（湘）2020-0017。大鼠心肌H9C2细胞购自于美国标准生物品收藏中心。

2 主要试剂

黄芪甲苷（Selleck）；H2O2（Sigma）；Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）检测试剂盒（南京建成有限公司）；caspase-3 活性检测试剂盒（碧云天公司）；cleaved caspase-3、核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，NRF2）、血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和 β-actin 抗体及 HRP 标记的山羊抗兔IgG（Abcam）。

3 主要方法

3.1 小鼠心肌I/R 损伤模型 心肌I/R 损伤小鼠造模方法根据文献［12］所述：C57BL/6 异氟烷吸入麻醉，仰卧固定于实验台，连接心电图，行气管插管术后连接小动物呼吸机。沿第3、4 肋间打开胸腔，剔除心包膜，结扎左冠状动脉前降支，观察小鼠心电图变化，以ST 段抬高作为判断结扎成功的标准。结扎30 min 后松开结扎点，恢复心肌血流供应。再灌注24 h后进行血流动力学指标测定和标本收集。

3.2 小鼠分组与给药 60 只C57BL/6 小鼠随机分成假手术（sham）组、模型（I/R）组与黄芪甲苷（I/R+AST）组，每组20只。sham组小鼠开胸后不结扎左冠状动脉前降支，I/R 组和I/R+AST 组小鼠制备心肌I/R损伤模型，I/R+AST 组在结扎30 min 后腹腔注射20 mg/kg黄芪甲苷［13］，I/R组注射等体积生理盐水。

3.3 小鼠心肌血流动力学指标测定 再灌注24 h后测定血流动力学指标，小鼠异氟烷吸入麻醉，采用Powerlab 生理记录仪检测小鼠左室压力下降最大速率（-dp/dtmax）和左室压力上升最大速率（+dp/dtmax）。

3.4 血清CK-MB 水平测定 再灌注24 h 后收集小鼠血液标本，室温静置 30 min，4 ℃、500×g离心 15 min，免疫抑制法检测血清中CK-MB 水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。

3.5 细胞处理前准备 分别采用不同浓度（0.25、0.5、0.75 和 1 mmol/L）的 H2O2和不同浓度（25、50 和100 μmol/L）的AST［13］处理H9C2细胞，以明确最终实验分组处理的剂量。

3.6 siRNA 转染 转染前 24 h 铺板，H9C2C 细胞按照每孔5×105的密度接种于6 孔板中，当细胞生长至50%时，依照Lipofectamine 2000 说明制备的siRNALipofectamine 2000复合物加入6孔板，培养箱内常规孵育6 h，更换为新培养基继续培养48 h 用于后续实验。siRNA 由上海吉玛公司合成：scrambled siRNA的序列为 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；NRF2siRNA 的序列为 5′-GUCAGCGACAGAAGGAUUATT-3′；HO-1siRNA 的 序 列 为 5′-GGAAAAUCCCAGAUCAGCATT-3′。

3.7 细胞实验分组和处理 细胞实验分为两个部分：（1）对照（control）组（常规培养）、模型组（H2O2组，H2O2处理）和H2O2+AST组（H2O2处理+AST处理）；（2）scrambled siRNA 组（scrambled siRNA 转染）、scrambled siRNA+H2O2组（scrambled siRNA 转 染 +H2O2处理）、NRF2siRNA+H2O2组（NRF2siRNA转染+H2O2处理）、HO-1siRNA+H2O2组（HO-1siRNA 转染+H2O2处理）、scrambled siRNA+H2O2+AST 组（scrambled siRNA 转染 +H2O2处理+AST 处理）、NRF2siRNA+H2O2+AST 组（NRF2siRNA 转 染 +H2O2处 理 +AST 处理，H2O2+AST）及HO-1siRNA+H2O2+AST 组（HO-1siRNA转染+H2O2处理+AST处理）。处理24 h后分别收集细胞上清液和细胞。

3.8 CCK8 法测定细胞活力 依照不同分组进行实验处理后，每孔加入 10 μL 的 CCK8 试剂，37 ℃孵育2 h后，测定490 nm的吸光度（A）值，并计算相对细胞活力。

3.9 LDH 法测定组织/细胞损伤 依照不同分组进行实验处理后，每孔加入10 μL 的LDH 释放试剂，37 ℃孵育1 h，500×g离心10 min，37 ℃孵育2 h后，每孔加入10 μL 的LDH 检测工作液，室温避光孵育30 min，测定490 nm的吸光度（A）值，并计算LDH含量。

3.10 检测caspase-3活性 依照不同分组进行实验处理后，每孔加入100 μL 的裂解液，冰浴裂解10 min，4 ℃、10 000×g离心 10 min 收集上清。加入 10 μL 的检测工作液，37 ℃孵育2 h 后，测定405 nm 的A值，并计算相对caspase-3活性。

3.11 Western blot 检 测 H9C2 细 胞 cleaved caspase-3、NRF2 和HO-1 蛋白水平 依照不同分组进行实验处理后，采用 RIPA 裂解 H9C2 细胞蛋白，BCA 法定量，10% SDS-PAGE 分离蛋白后转移至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，I 抗（1∶2 000）孵育过夜，II 抗（1∶5 000）孵育1 h，ECL 化学发光液显色，凝胶成像采集图片，以β-actin作为内参照分析蛋白相对表达水平。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 进行统计学分析和图形绘制。计量资料用均数±标准差（Mean±SD）表示。多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK（Student-Newman-Keuls）法。P＜0.05 代表差异有统计学意义。

结 果

1 黄芪甲苷对心肌缺血再灌注损伤小鼠的影响

与 sham 组相比，I/R 组小鼠 LDH 和 CK-MB 释放显著增多，±dp/dtmax下降（P＜0.01）；与I/R 组相比，黄芪甲苷组小鼠 LDH 和 CK-MB 释放减少，±dp/dtmax有所上升（P＜0.01），见图1。

2 不同浓度H2O2诱导的H9C2 细胞活力和凋亡的影响

与control 组相比，随着处理浓度的增大，0.5、0.75 和 1 mmol/L 的 H2O2组 H9C2 细胞活力呈显著降低趋势，caspase-3活性呈现显著上升趋势（P＜0.01），见图2。并根据细胞活力和caspase-3 活性变化趋势，选择0.75 mmol/L的H2O2组用于后续研究中。

3 黄芪甲苷对H2O2诱导的H9C2 心肌细胞损伤的影响

与对照组相比，不同浓度的黄芪甲苷处理H9C2细胞后LDH 释放无显著差异（P＞0.05）；与control 组相比，H2O2组 H9C2 细胞 LDH 释放显著增多、细胞活力显著降低、caspase-3 活性和cleaved caspase-3 蛋白表达显著增高（P＜0.01）；与H2O2组相比，H2O2+AST组H9C2 细胞LDH 释放显著减少、细胞活力显著增强、caspase-3 活性和cleaved caspase-3 蛋白表达显著降低（P＜0.01），见图3。

4 黄芪甲苷对H2O2诱导的H9C2 心肌细胞NRF2/HO-1表达的影响

与 control 组 相 比 ，H2O2组 H9C2 细 胞 NRF2 和HO-1 蛋白表达增多（P＜0.05）；与H2O2组相比，H2O2+AST 组 H9C2 细胞 NRF2 和 HO-1 蛋白表达显著增多（P＜0.01），见图4。

5 NRF2/HO-1 siRNA 对黄芪甲苷拮抗H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响

Figure 1. Effect of astragaloside IV（AST）on myocardial ischemia-reperfusion（I/R）injury mice. A：serum LDH activity；B：serum CK-MB activity；C：-dp/dtmax；D：+dp/dtmax. Mean±SD. n=20.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I/R group.图1 黄芪甲苷对心肌I/R损伤小鼠的影响

Figure 2. Effect of different concentrations of H2O2 on the viability and apoptosis of H9C2 cells. Mean±SD. n=8.**P＜0.01 vs control group.图2 不同浓度H2O2诱导的H9C2细胞活力和凋亡的影响

与 scrambled siRNA 组相比，scrambled siRNA+H2O2组细胞 HO-1、NRF2 和 cleaved caspase-3 蛋白水平升高，caspase-3 活性增强，LDH 释放增加，细胞活力下降（P＜0.05）；与scrambled siRNA+H2O2组相比，NRF2siRNA+H2O2组 和HO-1siRNA+H2O2组 细 胞HO-1 和NRF2 表达水平显著降低，cleaved caspase-3蛋白水平和caspase-3活性显著升高，LDH释放增加，细胞活力降低（P＜0.05）；与scrambled siRNA+H2O2+AST 组 相 比 ，NRF2siRNA+H2O2+AST 组 和HO-1siRNA+H2O2+AST组细胞caspase-3活性增强，LDH释放增加，细胞活力降低（P＜0.05），见图5。

讨 论

心肌缺血-再灌注损伤是心肌缺血性疾病治疗过程中最常发生的病理生理学现象［14］，缺血-再灌注损伤会造成一定程度的心肌细胞受损，导致患者心功能降低，严重者甚至导致死亡［15］。心肌细胞再生能力相当有限，因此探索心肌缺血-再灌注损伤的发病机制，寻找新的治疗策略，研发疗效更好、副作用更少的药物十分必要。

黄芪甲苷具有广泛的生物学活性，已有研究表明，黄芪甲苷具有抑制钙超载、抗氧化等作用［16-17］，还能抑制慢性心力衰竭大鼠心室重塑，纠正异常的能量代谢，保护心肌损伤［18］。此外，黄芪甲苷对心肌缺血再灌注损伤有一定的疗效，为了进一步明确黄芪甲苷在治疗心肌缺血再灌注损伤中的作用和机制，本研究通过左冠状动脉前降支结扎复制心肌缺血再灌注损伤小鼠模型，给予黄芪甲苷干预后评估其效果。本研究结果显示，黄芪甲苷可抑制心肌缺血再灌注损伤模型小鼠血清LDH 和CK-MB 的释放，改善心肌血流动力学指标；而黄芪甲苷能减轻H2O2诱导的心肌H9C2 细胞模型的细胞损伤和凋亡。说明黄芪甲苷的确能减轻心肌缺血再灌注损伤。

Figure 3. The effect of astragaloside IV（AST）on the injury of H9C2 cells induced by H2O2. LDH activity（A and B），cell viability（C），caspase-3 activity（D）and cleaved caspase-3（E）were detected. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2 group.图3 黄芪甲苷对H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响

Figure 4. The effect of astragaloside IV（AST）on the expression of NRF2 and HO-1 in H2O2-induced H9C2 cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs H2O2 group.图4 黄芪甲苷对H2O2诱导的H9C2心肌细胞NRF2和HO-1表达的影响

心肌缺血再灌注损伤过程中氧化应激的异常激活在心肌组织损伤中起到重要作用［19］。NRF2/HO-1信号通路是细胞抗氧化防御机制的一个组成部分，研究报道NRF2 通过上调HO-1 表达，对抗再灌注期的氧化应激水平升高，减轻细胞损伤，从而达到心肌保护的作用［20］。Yu 等［21］的研究表明二烯丙基三硫化物通过激活NRF2/HO-1介导的抗氧化剂信号通路保护心肌缺血再灌注损伤。NRF2/HO-1 信号通路可能成为心肌缺血再灌注损伤的调控靶点。本研究结果显示，H2O2组 H9C2 细胞 NRF2/HO-1 高表达。ROS蓄积所产生的刺激使细胞NRF2 活化并上调HO-1，发挥反馈性保护作用［22］。黄芪甲苷进一步增多NRF2/HO-1 表达，说明黄芪甲苷可能是通过NRF2/HO-1 信号通路调节氧化应激来实现对心肌缺血-再灌注损伤的保护。

Figure 5. The effect of NRF2/HO-1 siRNA on H2O2-induced injury of H9C2 cells treated with AST. The results of Western blot（A，n=3），cell viability（B，n=6），LDH activity（C，n=6）and caspase-3 activity（D，n=6）were shown. Mean±SD.**P＜0.01 vs scrambled siRNA group；#P＜0.05 vs scrambled siRNA+H2O2 group；&P＜0.01，&&P＜0.05 vs scrambled siRNA+H2O2+AST group.图5 NRF2/HO-1 siRNA对黄芪甲苷拮抗H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响

为了进一步证实黄芪甲苷通过NRF2/HO-1信号通路发挥心肌缺血-再灌注损伤的保护，我们利用siRNA 敲减 H9C2 细胞NRF2和HO-1，结果显示降低NRF2 和HO-1 表达后，黄芪甲苷对H2O2诱导的心肌H9C2 细胞模型损伤和凋亡的保护作用受到抑制。这表明NRF2/HO-1信号通路是黄芪甲苷保护心肌缺血再灌注损伤的调控靶点。

综上所述，本研究证实黄芪甲苷通过上调NRF2/HO-1 信号通路抑制心肌细胞损伤和凋亡，对缺血再灌注损伤的心肌发挥保护作用。