枸橼酸铁铵和铁蛋白对原代培养腹侧中脑神经元VMAT-2和DAT表达影响

肖志新,宋立梅,谢俊霞,徐华敏

(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是第二大常见的神经系统退行性疾病，主要临床表现有运动迟缓、静止性震颤、姿势反射障碍等[1-3]。其病理性特征是黑质(SN)多巴胺(DA)能神经元进行性缺失[4]。迄今为止PD的病因尚未完全阐明，越来越多的证据表明，SN铁的过度沉积可能是PD发病的关键因素之一[5-13]。SN铁增加会产生活性氧和活性氮物质，刺激细胞内α-突触核蛋白形成，导致DA能神经元变性[14-15]。在脑内铁主要与铁蛋白结合，铁蛋白是一种可储存多达4 500个铁原子的蛋白质[16-17]，有含铁铁蛋白(Ferritin)和去铁铁蛋白(Apoferritin)两种形式[18]。有研究表明，铁蛋白可能不仅是细胞内的铁储存者，也可能是参与组织和全身铁调控的重要因素[19]。但铁蛋白在DA稳态中起的作用尚不明确。

单胺囊泡转运蛋白-2(VMAT-2)是位于DA能神经元突触囊泡的一种膜蛋白，可以将胞浆内游离的DA转运到囊泡内，并调节随后的释放。它通过向单胺能神经元传递DA小泡来保护DA能神经元[20]。多巴胺转运蛋白(DAT)在SN神经元胞体和树突中大量表达[21-23]，可将DA从细胞外迅速转运到突触前神经元胞质内，以维持细胞内外DA稳态。但是在高铁以及存在外源性铁蛋白的状态下，原代培养腹侧中脑神经元中VMAT-2和DAT的表达是否改变尚不清楚。本实验旨在探究高铁、Ferritin和Apoferritin对原代培养的腹侧中脑神经元VMAT-2和DAT表达的影响。现将实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原代培养的腹侧中脑神经元细胞(取自孕14 d的Wistar大鼠的胎鼠腹侧中脑)，DMEM/F12培养液、2.5 g/L的胰酶(美国Hyclone公司)，B27营养因子、胎牛血清(美国Gibco公司)，青霉素-链霉素溶液(100×，中国索莱宝科技有限公司)，D-多聚赖氨酸、枸橼酸铁铵(FAC)、Ferritin、Apoferritin(美国Sigma公司)，VMAT-2抗体和DAT抗体(中国上海Abcam公司)，ECL发光液(Millipore公司)。

1.2 原代腹侧中脑神经元的培养

实验前将实验器械进行高压处理，提前3 h用D-多聚赖氨酸铺培养板，以高压灭菌水清洗3次放置超净台内备用。将孕14 d的Wistar大鼠以联合麻醉药深度麻醉后，用体积分数0.75的乙醇进行腹部消毒，沿中线剪开，取出串珠样胚胎，放置在预冷的DMEM/F12培养液中。将胚胎移至超净台中显微镜下，在冰上操作，剖开胚胎外膜取出胎鼠置于另一装有DMEM/F12培养液的玻璃皿中。使用眼科镊、眼科剪将中脑部分取出，去除端脑及血管膜，修剪组织留出蝴蝶状的腹侧中脑，将其转移至含预冷DMEM/F12培养液的玻璃皿中。去除DMEM/F12培养液，加入37 ℃预温的2.5 g/L胰酶，在培养箱中消化5 min。加入含有胎牛血清的终止液终止消化。用移液器将组织吹打成单细胞悬液，用蓝枪头吹打约10次，收集单细胞悬液至50 mL离心管中，后套用黄枪头和白枪头重复上述操作。将装有单细胞悬液的离心管以1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入含有B27和双抗的DMEM/F12培养液，用吸管吹打成细胞悬液，以2×108/L的密度种板。此后每隔2 d换1次液，第6天细胞成熟可用于实验。

1.3 实验分组及处理

实验分为对照组、FAC处理组、Ferritin处理组和Apoferritin处理组，将原代培养的腹侧中脑神经元培养液换成DMEM/F12基础培养液，对照组细胞只用DMEM/F12基础培养液孵育，FAC处理组细胞加入100 μmol/L的FAC，Ferritin处理组细胞加入80 μmol/L的Ferritin，Apoferritin处理组细胞加入50 μmol/L的Apoferritin。将各组细胞置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中孵育24 h。

1.4 VMAT-2和DAT的蛋白免疫印迹(Western Blot)检测

在6孔板中加入100 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，用刮板将板底的细胞刮下，用移液器转移至1.5 mL的EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min。用移液器吸取80 μL上清至另一EP管中，使用BCA试剂盒检测上清中蛋白质浓度，加入5×Loading Buffer，95 ℃煮5 min。按照BCA试剂盒检测的蛋白浓度计算SDS-PAGE凝胶电泳的上样量。加入样品后，调节电压至80 V，待样品进入分离胶后，将电压调至120 V，电泳之后将蛋白转至PVDF膜上，以300 mA湿转90 min，切下所需分子量的条带，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h后，再加入用含50 g/L脱脂奶粉的TBST稀释的VMAT-2抗体(稀释度为1∶1 000)、DAT抗体(稀释度为1∶1 000)和β-actin抗体(稀释度为1∶10 000)孵育相应的条带，4 ℃摇床过夜。用TBST洗条带3次，每次10 min，加入HRP偶联的山羊抗兔二抗(稀释度为1∶10 000)，室温孵育1 h，孵育完成后以TBST洗3次，每次10 min。加ECL发光液避光孵育1 min显影。利用Image J软件对条带进行分析，以目的条带与内参照条带的比值作为目的蛋白的相对含量。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 FAC、Ferritin和Apoferritin对原代培养的腹侧中脑神经元VMAT-2表达的影响

对照组、FAC处理组、Ferritin处理组和Apoferritin处理组细胞内的VMAT-2蛋白表达水平分别为1.175±0.075、0.938±0.044、0.945±0.046和0.921±0.062(n=17)。与对照组相比，FAC处理组、Ferritin处理组和Apoferritin处理组VMAT-2蛋白表达水平明显降低，差异具有统计学意义(F=4.295，q=3.952～4.370，P<0.05)，而Ferritin处理组与Apoferritin处理组相比差异无显著意义(q=0.417，P>0.05)。

2.2 FAC、Ferritin和Apoferritin对原代培养的腹侧中脑神经元DAT表达的影响

对照组、FAC处理组、Ferritin处理组和Apoferritin处理组细胞内DAT蛋白表达水平分别为0.910±0.055、0.931±0.679、0.937±0.056、0.958±0.088(n=12)，各组间比较，差异均无显著性(F=0.084，q=0.297～0.706，P>0.05)。

3 讨 论

PD是全球第二大神经退行性疾病，其发病与年龄老化、氧化应激、炎症反应、环境因素、遗传因素等有关。越来越多的证据表明，SN铁过度沉积参与了PD的发病，过多的铁激活的小胶质细胞会释放大量的神经炎性因子，增加了DA能神经元的变性[24]。在脑内，铁主要与铁蛋白结合，铁蛋白两种亚型以互补的方式储存细胞内的铁[25]。

有研究提出DA作用的区域概念，VMAT-2和DAT在调节这些区域之间DA转移中起着核心作用[26-27]。VMAT-2将突触前神经元合成的DA摄取到突触囊泡中，释放到突触间隙，从而作用到相应的受体。而DAT可以将突触间隙的DA重新摄取到突触前神经元。它们共同调节DA活性，从而改变DA的含量[28]。本文研究结果显示，给予高铁会导致原代培养的腹侧中脑神经元的VMAT-2表达降低。有实验研究表明，当VMAT-2水平降低约95%时，小鼠表现为DA稳态失调，而且神经元对多种有毒化合物的敏感性增强[29-34]。这提示高铁导致的VMAT-2表达降低可能影响了DA的释放，从而引起DA稳态失调。本文结果还显示，给予铁蛋白后，细胞VMAT-2的表达也会下降，说明腹侧中脑神经元VMAT-2的表达变化不是铁依赖性的，铁蛋白和铁均可通过影响VMAT-2的表达参与DA稳态调控。Western Blot结果显示，经高铁及铁蛋白处理的腹侧中脑神经元DAT的表达没有发生明显变化，提示高铁及铁蛋白并不影响DA重新摄取到突触前神经元。以上结果提示，高铁及铁蛋白能够减少突触前神经元的DA释放，但并不影响DAT介导的DA重新摄取，这就导致了DA的稳态失调，可能增加了神经元对有毒物质的敏感性。本实验以原代细胞为模型，更好地探究了高铁诱导的DA代谢和转运情况，为开发影响DA稳态的铁螯合剂提供了新的依据，也为PD的治疗提供了新的思路。