肾移植排斥反应免疫风险评估与监测

郑瑾 薛武军

肾移植是终末期肾衰竭最有效的治疗方法。虽然目前移植肾早期存活率及功能恢复都得到了很大的提高，但是长期存活率仍有待改善。导致移植肾衰竭的常见因素包括：同种异体免疫导致的排斥反应，免疫抑制剂毒性作用导致的间质病变以及移植物肾病复发或新发肾病。其中免疫因素导致的抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）及T细胞介导的排斥反应（T cell-mediated rejection，TCMR）仍是移植肾衰竭的最主要因素[1-2]。免疫风险评估与监测不仅是肾移植成功的关键，也是术后个体化免疫抑制治疗的关键。本文对肾移植受者术前及术后排斥反应免疫风险评估与监测进行阐述。

1 肾移植免疫风险评估及监测的重要性

精准的免疫风险评估不仅是肾移植成功的关键，也是肾移植术后受者个体化管理的关键。其作用主要体现在制定和规划致敏受者脱敏治疗方案、免疫诱导方案、维持治疗方案、术后免疫状态监测内容及监测频率。根据免疫风险评估结果，对肾移植等待者进行分层监测，有利于肾移植术后受者进行个体化免疫抑制治疗及免疫监测，及时发现排斥反应。除此之外，还可以根据免疫监测结果避免无效治疗或过度治疗，从而优化移植肾长期存活[3]。

2 肾移植免疫风险评估及监测内容

2.1 等待肾移植期间的免疫风险评估

肾移植等待者体内可能引发术后移植物排斥反应风险的抗体包括人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗体和非HLA抗体。另外，肾移植受者术前血清CD30水平及B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）水平的高低和术后早期排斥反应也有着密切的关系。因此，在等待移植期间对患者体内免疫分子进行评估至关重要。

2.1.1 HLA抗体 体内存在HLA抗体的患者被认为处于致敏状态，尤其是存在高水平供者特异性抗体（donor specific antibody，DSA）的患者。目前普遍认可的标准以群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）为依据，其中PRA>20%为致敏，PRA>80%为高致敏。2009年美国器官资源共享网络（United Network for Organ Sharing，UNOS） 开始采用校准PRA（calculated PRA，cPRA）来评估受者的致敏程度。cPRA是针对目标人群的HLA频率，计算供者HLA不能被致敏受者接受的百分比[4]。美国器官获取和移植网络（Organ Procurement and Transplantation Network，OPTN）把高致敏定义为cPRA达到98%～100%[5]。欧洲移植肾脏分配系统自1980年开始采用虚拟PRA（virtual PRA，vPRA），其计算方式近似于cPRA[6]。研究发现，vPRA和肾移植等待者峰值PRA（peak PRA，pPRA）均为评估移植物致敏作用和预测移植物长期生存提供了可靠的方法[7]。预存DSA（preformed DSA，pfDSA）的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）值越高，移植术后发生AMR的风险越高[8]。

2.1.2 非HLA抗体 非HLA抗体主要包括次要组织相容性复合体抗体，如主要组织相容性复合体Ⅰ类链相关蛋白A（major histocompatibility complex classⅠ-related chain A，MICA）抗体、谷胱甘肽S-转移酶 T1（glutathione-S-transferase T1，GSTT1） 抗 体和抗自身组织抗原抗体，如血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R）抗体、蛋白激酶 Cζ（protein kinase C zeta，PRKCZ）抗体等[9]。研究发现，对非HLA抗体水平高的患者术前进行脱敏处理，可以减少围手术期并发症的发生[10]。

2.2 肾移植手术前免疫风险评估

供、受者HLA匹配程度，淋巴细胞毒交叉配型及受者体内是否存在针对移植肾的免疫记忆细胞是诱发移植物排斥反应的主要危险因素。

2.2.1 HLA匹配 随着HLA高特异性分子分型方法和等位基因特异性抗HLA抗体的固相分析技术的出现，组织配型技术也得到了迅速的发展。配型方法有以下几种：HLA六抗原位点匹配（HLA-A、B、DR）、基于交叉反应组的氨基酸残基匹配、基于HLA 功能表位（eplet）的HLA Matchmaker 匹配、基于抗原表位（epitope）的PIRCHE匹配、基于氨基酸表面静电势的静电匹配及基于HLA氨基酸序列的氨基酸序列匹配[11]。目前国内常用的是HLA六抗原位点匹配和氨基酸残基匹配，其余匹配方法由于需要HLA高特异性分子分型结果，目前尚未被广泛采用。无论采用哪一种方法，都是遵循少错配的原则。错配数越高，术后发生移植物排斥反应的风险越高。研究报道，eplet错配数越高，肾移植术后DSA产生概率越大，移植物存活率越低[12-13]。供、受者HLA Ⅱ类抗原位点（DR、DQ）的错配，导致肾移植受者术后发生AMR和移植物丢失的概率增高，说明了供、受者DR和DQ匹配的重要性[14]。静电匹配是通过生物信息学方法，预测HLA的结构，计算氨基酸表面静电势，定量分析两种HLA间的静电势差异，来预测体液免疫反应[15]。另外，HLA的免疫原性，也是导致移植物排斥反应的重要危险因素。研究发现，虽然供、受者HLA错配数的增加与新生DSA（de novoDSA，dnDSA）之间存在很强的相关性，但仍有部分患者，尽管HLA错配数较低，却仍旧出现dnDSA。因此，研究者又提出了产生DSA和非DSA的等位基因的独特错配和共享错配的观点，具体机制还有待于进一步的研究验证[16]。

2.2.2 淋巴细胞毒交叉配型 淋巴细胞毒交叉配型包括补体依赖淋巴细胞毒交叉配型试验（complementdependent cytotoxicity crossmatch，CDC-XM）、流式细胞交叉配型试验（ flow cytometry crossmatch，FCXM）和基于Luminex技术的固相抗体筛选的方法[17]。传统CDC-XM可以检测受者体内是否存在可以结合淋巴细胞表面HLA并且激活补体的抗体。然而，此方法灵敏度不高，对于低抗体滴度的HLA抗体容易出现假阴性，对于存在自身抗体的血清会出现假阳性。FCXM通过细胞表面标志物，可以分别结合T细胞和B细胞的HLA抗体，无论是否与补体结合。此方法灵敏度高于CDC-XM，但是对于体内存在自身抗体的受者也会出现假阳性。固相抗体筛选的方法是利用包被单一HLA的微球，检测受者血清抗HLA抗体，被称为单抗原珠（single antigen bead，SAB）检测，灵敏度高。然而，由于单一抗原微球上包被的是变性HLA，因此此方法有可能导致假阳性结果[18]。SAB检测增强了HLA抗体检测能力，虚拟交叉配型（virtual crossmatch，VXM）的概念逐渐被接受。VXM的定义是一种基于受者同种抗体与供者HLA的免疫相容性评估。由于VXM增强了识别DSA的能力，减少了不必要的交叉配型，增加了高致敏患者找到交叉配型兼容供者的可能性，因此在许多情况下VXM比CDC-XM或FCXM具有更显著的优势[19]。

2.2.3 免疫记忆细胞 目前，对肾移植受者体内免疫记忆细胞的临床评估还没有成熟的方法，只能依赖于对受者潜在的同种异体免疫记忆事件的评估，包括妊娠、输血、移植、支架植入手术等HLA致敏事件，以及可能会增强已有的同种免疫记忆炎症反应事件，如大的外科手术、感染、近期接种疫苗等。只有那些没有HLA致敏事件的受者是同种免疫记忆的低风险人群[20]。对记忆性B细胞的检测目前还局限于实验室检测，有以下3种方法：（1）利用流式细胞术检测可以结合供者HLA的记忆性B细胞，这种方法快速，但是灵敏度低，而且不能评价记忆性B细胞分泌抗体的能力；（2）利用酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）检测可以分泌抗HLA免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G的记忆性B细胞，可检测记忆性B细胞分泌抗体的能力，但是对于数量少的记忆性B细胞灵敏度低；（3）利用ELISPOT或荧光斑点法（Fluorospot）技术检测分泌特异性抗HLA IgG的记忆性B细胞，可检测特异性记忆性B细胞分泌抗体的能力，但是实验过程复杂，耗时且试剂费用昂贵[11]。记忆性T细胞检测采用的方法包括ELISPOT和流式细胞术。ELISPOT可以检测分泌抗HLA特异性干扰素（interferon，IFN）-γ的记忆性T细胞；流式细胞术通过检测T细胞表面标志物来判定是否为记忆性T细胞，但不能确定是否为供者HLA反应性记忆性T细胞。目前最有可能应用于临床的检测记忆性T细胞的方法是流式HLA四聚体技术，将藻红蛋白标记的HLA四聚体和异硫氰酸荧光素标记的抗CD8抗体及淋巴细胞混合孵育，最后利用流式细胞术检测出的双阳性细胞为特异性记忆性T细胞[11]。

2.3 肾移植术后免疫状态监测

肾移植术后，移植肾不仅存在被受者免疫系统排斥的风险，还存在发生免疫抑制剂不良反应、感染、恶性肿瘤等风险。如何把握免疫抑制治疗的最佳状态，持续的免疫监测发挥着关键作用。免疫监测是指对移植受者免疫系统针对移植物同种异体抗原的反应程度进行检测。监测内容主要涉及移植肾程序性活组织检查（活检）、免疫细胞、HLA抗体及非HLA抗体、供者来源性细胞游离DNA（donor-derived cell-free DNA，dd-cfDNA）、外泌体、基因组学等。

2.3.1 程序性活检 移植肾程序性活检在急性排斥反应、免疫抑制剂毒性损伤、病毒感染、原发或继发性肾小球疾病等术后并发症的诊断中发挥重要作用。研究表明，程序性活检有助于明确移植肾对免疫抑制治疗的反应，可早期干预肾移植受者的治疗，延长移植物的存活时间。同时，程序性活检在诊断亚临床排斥反应、轻度慢性移植肾病变以及高危受者术后移植肾状态等方面也具有非常重要的意义[21-23]。程序性活检还可以鉴别由免疫因素和非免疫因素引起的慢性移植肾失功[21]。然而，对于程序性活检是否在肾移植受者术后常规开展，还需要大规模、多中心、前瞻性的临床试验，以确定程序性活检的标准和最佳时机。

2.3.2 免疫细胞 在肾移植术后急性排斥反应中，免疫细胞亚群参与抗原识别、免疫调节、细胞毒效应等一系列免疫反应，并发挥了重要作用。T细胞是免疫抑制剂作用的主要靶细胞，其数量和功能的变化亦反映了免疫抑制程度。研究发现，肾移植术后发生急性排斥反应时，CD4+/CD8+比值显著升高，且在逆转后下降，表明监测机体T细胞亚群比例的变化情况，不仅对于急性排斥反应的诊断有一定临床意义，而且可以作为抗排斥反应治疗的疗效和预后判定的参考指标之一[24]。目前，几种细胞疗法已经被引入肾移植受者的临床试验中。研究者探索了几种调节性免疫细胞在肾移植中的保护作用，包括调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）、T调节性1型细胞（T regulatory type 1 cell，Tr1）、树突状细胞（dendritic cell，DC）和调节性巨噬细胞（regulatory macrophage，Mreg）[25]。近年来，B细胞在免疫调节中的重要作用已经确立。临床前研究表明，调节性B细胞（regulatory B cell，Breg）在动物模型中可以延长同种异体移植物的存活时间，并诱导Treg，发挥免疫耐受的作用[26]。这些研究表明，调节性免疫细胞在肾移植术后的免疫监测以及排斥反应治疗中具有重要的意义和较大的潜在应用价值。

2.3.3 HLA抗体 肾移植术后受者体内产生的HLA抗体包括DSA和非DSA。DSA已经成为预测AMR的一个确定的生物标志物[27-28]。研究发现，DSA或非DSA与移植物存活率较低、移植物功能较差和尿蛋白升高显著相关[29]。肾移植术后HLA抗体的筛查对于受者术后免疫抑制方案的调整具有非常重要的指导作用。AMR的发病机制不仅包括补体依赖的细胞毒作用，还包括非补体依赖的抗体介导的细胞毒作用、直接的内皮细胞激活和增殖途径。HLA抗体特征如所针对的HLA类别、特异性、抗体强度、IgG亚类别和补体结合能力等显著影响AMR的类型和机制。致敏受者体内pfDSA可诱发超急性排斥反应、加速急性排斥反应和早期活动性AMR（active AMR，aAMR）。dnDSA与晚期AMR、慢性活动性AMR（chronic active AMR，caAMR）和移植肾肾小球病变相关。补体C1q结合的DSA与aAMR、更严重的移植物损伤和早期移植物衰竭密切相关，而非C1q结合的DSA与亚临床AMR或caAMR和晚期移植物丢失相关[30]。HLA抗体不同的IgG亚型可通过Fc受体发挥激活补体和招募效应细胞的能力。补体结合的IgG3型DSA常与aAMR和严重的移植物损伤相关，而非补体结合的IgG4型DSA则与亚临床AMR或caAMR和移植肾肾小球病变相关[31]。对DSA特征的深入了解有助于肾移植受者的免疫风险分层，也可以预测AMR的不同类型，并有望指导临床治疗方案以改善移植结果。

2.3.4 非HLA抗体 研究发现，在发生AMR过程中存在直接针对非HLA的抗体[32]。常见的诱发AMR的非HLA抗体包括MICA、GSTT1、AT1R及PRKCZ抗体等。MICA是在应激状态下由内皮细胞、上皮细胞等表达的一种应激标志物，作为自然杀伤（natural killer，NK）细胞、NKT细胞、γ σT细胞、CD8+T细胞表面的NK细胞活化受体的配体，能够激活细胞毒反应，增加移植物失功的风险[33]。GSTT1是催化还原型谷胱甘肽与多种亲电、疏水化合物结合的蛋白质超家族的成员，定位于细胞质，主要在肝脏和肾脏中表达。研究发现，41.7%的GSTT1抗体阳性的肾移植受者发生急性排斥反应，GSTT1抗体阳性是肾移植受者发生急性排斥反应的危险因素[9,34]。AT1R是表达于内皮细胞、足细胞表面的G蛋白耦联受体，可与血管紧张素Ⅱ结合并调节水盐平衡及血压。AT1R抗体定量超过40 U/mL（阈值4倍）时极易发生AMR。移植术前预存AT1R抗体也是术后发生排斥反应的危险因素之一[35-36]。PRKCZ是蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族的成员，参与细胞增殖、分化和分泌等过程。术前预存的高浓度PRKCZ抗体会导致术后发生急性AMR。术后PRKCZ抗体的MFI值超过阈值4倍的肾移植受者通常会发生AMR[37]。

2.3.5 供者来源性细胞游离DNA 移植物严重损伤（主要是急性排斥反应导致的损伤）将导致部分细胞凋亡，使大量游离DNA脱落到外周血中，通过检测外周血中dd-cfDNA的含量，可以预测移植物的损伤情况[38-39]。其基本原理是通过二代测序技术测量受者和供者所有的细胞游离DNA（cell-free DNA, cfDNA），后续通过供、受者单核苷酸多态性的差异，区分受者cfDNA和dd-cfDNA。dd-cfDNA含量占总cfDNA含量的比例即为最终结果。cfDNA检测作为一种无创检测，具有检测风险低、灵敏度高、能够多次实时监测等特点，逐渐成为一种临床常规检测手段。由于cfDNA检测具有无创性，还可以取代部分活检穿刺的诊断作用，不少学者将其称之为液态活检。dd-cfDNA联合DSA检测，其阳性预测值显著上升，能明确提示AMR的发生。

2.3.6 细胞外囊泡 细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）包括外泌体、细胞微泡和凋亡囊泡，在先天性免疫系统和适应性免疫系统细胞之间的通信中发挥重要作用[40]。近年来的研究表明，EV通过将供者主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）抗原转移到受者抗原提呈细胞，从而促进T细胞的同种异体免疫。另一方面，强有力的间接证据表明EV和供者MHC的异位参与了同种异体移植免疫耐受[41]。然而，EV产生细胞的确切性质及其对排斥反应或免疫耐受的同种免疫影响机制仍不清楚。但是，越来越多的证据表明移植物在血液和尿液中释放的EV所携带的蛋白质和信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）反映了排斥反应的性质和阶段[42]。进一步验证EV作为排斥反应或免疫耐受的生物标志物，可以避免侵入性活检的需要，并有助于调整移植受者的免疫抑制治疗。

2.3.7 基因组学 微小核糖核酸（micro RNA，miRNA，miR）是一种小的非编码RNA，可以抑制其互补靶mRNA的翻译，从而控制基因的表达。深入了解肾移植术后血细胞中miRNA的调控不仅可以发现潜在的生物标志物，还可以加深对完全不同的病理过程及其进展所涉及的分子机制的理解。研究发现miR-223-3p 在移植肾功能稳定受者中的表达显著高于发生AMR和TCMR受者，miR-424-3p 在发生TCMR受者中的表达水平显著低于稳定受者和发生AMR受者，而miR-145-5p在间质纤维化和肾小管萎缩（interstitial fibrosis and tubular atrophy，IFTA）组受者的表达水平显著低于其他各组[43]。另一项研究发现，与正常的肾移植受者相比，IFTA受者miR-148a表达水平显著降低[44]。Van Loon等[45]在一项多中心、前瞻性临床研究中鉴定并验证了外周血8个基因表达谱试验，该试验对于AMR具有良好的诊断准确性。8个基因包括CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）10、IgG Fc段受体Ⅰ A（ Fc gamma receptorⅠ A，FCGR1A）、IgG Fc段受体ⅠB（Fc gamma receptorⅠB，FCGR1B）、鸟苷酸结合蛋白（guanylate binding protein，GBP）1、GBP4、白细胞介素（interleukin，IL）-15、杀伤细胞凝集素样受体亚家族C1（killer cell lectin like receptor C1，KLRC1）、基质金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP1），其检测在移植术后1年内和1年后的移植物功能稳定时和移植物功能障碍时，都保持了对AMR诊断的准确性。然而，基因组学作为评价移植物免疫状态及功能的标志物，还需要更大样本的前瞻性研究进一步评估和验证。

3 肾移植免疫风险评估容易混淆的主要术语

免疫风险评估涉及很多专业术语，其中一些术语在文献交流中常常存在混淆和误用的现象。明确这些术语的概念并且正确地使用，不仅有利于临床研究结果之间进行比较、归纳和总结，也有利于促进相关实践指南的制订和改进。下面就免疫风险评估常见易混淆和误用的术语进行介绍。

3.1 抗体MFI≠抗体滴度

一些MFI值相对较高的HLA抗体通过稀释，MFI值可能很快下降，因此不属于高滴度抗体。目前，HLA抗体MFI评估作为定量分析还没有得到美国食品与药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的许可。

3.2 0%PRA≠免疫幼稚状态

肾移植等待者可能通过妊娠或输血暴露于同种HLA，并对其产生应答，但完全有可能在当前的血清中检测不到HLA抗体。因此，没有检测到HLA抗体并不意味肾移植等待者未接触过HLA。

3.3 可接受的HLA不匹配≠免疫幼稚状态

肾移植等待者出现特异性HLA抗体时，使用“不可接受的HLA”一词，以避免由于免疫记忆反应相关的风险而导致移植失败。一般认为，根据可接受抗原可以推断出受者对移植物HLA没有免疫记忆，或受者体内没有可接受HLA的特异性抗体。但是，在许多情况下DSA MFI值低于风险阈值并不意味着HLA抗体不存在，或受者未接触过这种HLA。

3.4 移植前DSA滴度≠移植后免疫记忆反应

通常认为移植术前HLA抗体的滴度可以用来预测术后免疫记忆反应的风险和强度。但是目前还没有有效的方法来确定低效价HLA抗体在移植术后会持续保持低滴度抗体水平或出现迅速升高的抗体滴度水平。

3.5 体外补体结合活性≠体内补体结合活性

补体激活很大程度上是高浓度DSA的结果。已经证明C1q的激活需要IgG六聚体聚集在细胞表面[46]。然而，血清中C1q-DSA+的患者经常会出现C4d+AMR，这表明C1q检测阴性并不意味着DSA不能在体内激活补体[47]。因此，虽然研究发现C1q+DSA+是移植物不良结局的潜在风险，但还需要更多的临床研究去考证。

3.6 抗原功能表位≠抗原表位

epitope是指抗体和抗原之间的完全接触区域，由15～25种氨基酸组成。eplet是epitope的一部分，是由2～5个氨基酸组成的集群，是理论上构成抗体Ig可变区重链（CDR H3）的结合位点[48]。目前，只有一部分eplet被证明具有抗原性。

4 小 结

精准的免疫风险评估与监测不仅是肾移植成功的关键，也是术后个体化免疫抑制治疗的关键。但是，目前对肾移植受者免疫风险评估仍然存在很多问题。对记忆性免疫细胞的临床评估尚无有效的方法，应用于临床评估免疫记忆细胞的方法还需进一步研发。另外，随着移植物存活时间的延长，TCMR发生率逐渐降低，AMR已经成为同种异体移植物长期预后的主要威胁。这一现象强调了B细胞免疫在免疫风险评估中的关键作用，也是未来免疫风险评估的重要内容。