细胞因子与重症肌无力分型及临床病程的相关性研究

梁翠娟 冯苏 范蓉 赵东兰 宋国威 潘婧

重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是由自身抗体介导的细胞免疫依赖的获得性自身免疫疾病[1]，多种免疫细胞包括Th1、Th17细胞、B细胞及细胞因子IL-6、IL-17、IL-27、TGF-β、IL-21被认为参与了重症肌无力的发病[2]。在动物模型中，IL-6抗体可以降低抗乙酰胆碱抗体(anti-AChR)水平，并下调IL-17、IL-21等表达。TGF-β可促进效应及调节性T细胞的分化，IL-6和TGF-β可诱导细胞分化为Th17细胞，促进炎症及自身免疫发生，在自身免疫性疾病中发挥着重要作用。同时IL-6和可以促进B细胞增殖分化成熟为成熟浆细胞。自身抗原在IL-17敲除小鼠不能或仅能诱导低水平抗乙酰胆碱抗体[3]。IL-27在自身免疫性疾病发病中具有复杂的作用，可拮抗IL-6，在多种自身免疫性疾病动物模型中抑制自身性免疫性疾病的发生。本研究对重症肌无力患者血清细胞因子进行检测，以期了解上述细胞因子与疾病表型、病程的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 我院2018年4～6月诊治的重症肌无力患者，诊断及分型标准参考《中国重症肌无力诊断和治疗指南2015》[1]，其中眼肌型26例，全身型24例。对照组为同期于我院进行体检的年龄和性别匹配的健康志愿者29例。在重症肌无力患者中，初发期(眼肌型13例，全身型6例)，稳定期18例(眼肌型9例，全身型9例)，加重期13例(眼肌型4例，全身型9例)。各期患者及对照组年龄及性别比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、2。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：近期无急慢性感染。排除标准：(1)合并慢性或急性炎症性疾病疾病；(2)合并恶性肿瘤；(3)合并精神性疾病；(4)合并其他疾病或使用可能影响上述细胞因子水平的治疗药物。

表2 不同病程阶段一般情况比较

1.3 判定标准 初发期为初次入院未进行任何治疗；稳定期为至少半年无肌无力的症状或体征,在此期间接受过MG 的药物治疗;经专业的神经肌病医生检查允许出现轻微眼睑闭合无力；加重期为与稳定期相比，肌无力临床症状明显加重或MG治疗药物剂量明显增加。参考美国重症肌无力基金会MGFA 干预后状态分级症状描述。

1.4 细胞因子检测 采用ELISA法测定血清IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21、IL-27浓度，由Multiskan FC酶标仪读取OD值，然后进行统计学分析。所用试剂盒为欣博盛QuantiCyto ELISA试剂盒IL-6(批号H171222-007a)、IL-17(批号H171222-170a)、IL-21(批号H171222-107a)，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学分析 应用SPSS 26.0统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料根据数据分布类型(非正态分布)采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与不同分型重症肌无力患者细胞因子水平比较 对照组血清IL-6水平[2.78(2.29～3.47)pg/ml]显著低于眼肌型[4.47(3.00～8.87)pg/ml]及全身型[4.61(2.56～9.42)pg/ml]重症肌无力患者(P<0.05)，而眼肌型与全身型重症肌无力患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。其他细胞因子TGF-β、IL-17、IL-21、IL-27血清浓度在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图1。

表3 对照组与眼肌型、全身型重症肌无力患者细胞因子比较 pg/ml,median(IQR)

图1 不同临床分型重症肌无力患者血清细胞因子比较

2.2 对照组及不同病程重症肌无力患者血清细胞因子比较 (1)血清IL-6：对照组低于初发阶段的重症肌无力患者(P<0.05)，而与稳定期、症状加重期重症肌无力患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。不同病程阶段的重症肌无力患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)血清IL-17、IL-21、IL-27、TGF-β：在对照组及各不同病程阶段重症肌无力患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图2。

3 讨论

IL-6可激活B细胞和T细胞，诱导Th17和Tfh细胞分化，并直接抑制Treg细胞，在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用[4-6]。本研究并未发现眼肌型和全

表4 对照组及不同病程重症肌无力患者细胞因子水平比较 pg/ml,median(IQR)

图2 健康对照和不同病程阶段重症肌无力患者细胞因子比较

身型重症肌无力患者血清IL-6存在显著性差异，这与一部分研究的结果[7]是类似的，而另外一些研究则发现，全身型重症肌无力患者血清IL-6水平要高于眼肌型患者[6]，这种差异可能由于入组患者病情严重程度不同所致，本研究中的全身型重症肌无力患者均为Ⅱ型及Ⅲ型。本研究发现，初发期重症肌无力患者血清IL-6水平显著高于健康对照者，而稳定期及加重期的患者血清IL-6水平与健康对照组差异无统计学意义。我院重症肌无力科对儿童眼肌型重症肌无力患者经健脾益气颗粒治疗前后的细胞因子进行了比较，发现治疗后12个月时血清IL-6、IL-17水平低于治疗前，并与临床症状缓解相关[8]。重症肌无力患者血IL-6升高的原因并不完全明确。在重症肌无力患者中，LPS可能通过上调P2X7R，增加IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等促炎因子释放[5]。在重症肌无力动物模型及患者肌细胞中可以观察到IL-6表达增加，体外试验更进一步证实，抗-AChR抗体可诱导人类肌细胞生成IL-6明显增加，并且这种作用是通过调节转录或通过转录后调节机制而非肌细胞增殖实现的[9]。此外，还有研究表明重症肌无力患者胸腺上皮细胞功能异常，可过量分泌IL-1、IL-6等细胞因子。IL-6独自或与其他细胞因子协同，参与免疫应答调节，在自身免疫性疾病中发挥着重要作用，如下调FoxP3表达，促进IL-17产生，与IL-1协同可促使FoxP3+细胞分泌IL-17，与TGF-β协同可使Treg细胞向Th17细胞转化[10]，通过STAT3—RORγt信号通路调节Th17细胞。体外细胞学试验提示，MG患者的Treg细胞功能异常可能与IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A信号通路相关[11]。在重症肌无力患者或动物模型中，IL-6可调节肌细胞蛋白分解，抗IL-6R抗体可拮抗这种作用[12]，并且下调IL-17、IL-21促炎因子，减少抗-AChR抗体生成，缓解重症肌无力症状[13]。IL-6基因敲除模型动物重症肌无力症状轻于野生型[14]。动物试验研究提示，抗IL-6抗体治疗可以减轻模型动物的肌无力症状[15]。结合我们及之前的研究，IL-6与重症肌无力发病及病情密切相关，可能是未来重症肌无力治疗重要靶点。

在本研究中，重症肌无力患者血清TGF-β与健康对照组差异无统计学意义，这与一些研究结果[16]是类似的。另外T细胞体外功能检测也未发现重症肌无力患者与健康对照组培养液中TGF-β的差异[17]，但也有研究显示重症肌无力患者血清TGF-β升高[18]，而另一项研究则发现重症肌无力患者TGF-β1水平较健康对照组降低，而在给予糖皮质激素治疗后升高[19]。在动物模型中，MG动物血清TGF-β1水平与对照组无差异[20]。TGF-β具有抗炎和促炎双重作用，在自身免疫调节中发挥着重要作用，在IL-6、IL-23存在时，TGF-β可诱导Th17细胞发挥促炎作用，而Treg细胞则通过TGF-β、IL-10、IL-25等细胞因子维持免疫耐受功能[21,22]。此外，TGF-β可能通过下调树突细胞功能及抑制IL-2分泌、上调Treg细胞功能、增加髓源性抑制细胞等，抑制T、NK细胞增殖、迁移、激活、发挥功能，可抑制细胞毒性CD8+T细胞细胞效应，如穿孔素、颗粒酶B和A、IFN-γ、FAS配体表达等，调节抗体产生，在免疫抑制和免疫耐受中发挥着重要作用[23]。动物试验表明，地塞米松可抑制TGF-β的表达[18]。骨髓间充质干细胞可通过TGF-β等可溶性分子抑制T细胞及B细胞功能，从而抑制抗-AChR抗体生成[21]。

IL-17家族包括6个亚型(IL-17A,IL-17B,IL-17C,IL-17D,IL-17E,和 IL-17F)，IL-17可诱导IL-6、TNF-α、IL-1β、G-CSF等促炎细胞因子，其过表达被认为与自身免疫疾病相关[14]，自身反应性T细胞具有分泌IL-17、IFN-γ和GM-CSF增多而IL-10减少的特点[2]。在本研究中，未发现重症肌无力患者血清IL-17与健康对照组存在显著性差异。有研究显示，全身型血清IL-17水平显著高于眼肌型及健康对照组[7]，并且眼肌型重症肌无力患者血清IL-17高于健康对照[6]，而另外一些研究则提示而眼肌型和健康对照者之间无差异[24]，甚至有研究发现全身型重症肌无力患者血IL-17水平显著下降，而在治疗后显著上升[25]。在 MuSK-MG患者研究中发现CD4+T细胞分泌IL-17增加[26]。Meriggioli等[17]发现重症肌无力患者CD4+CD25high CD127low/Treg细胞功能特别是抑制IL-17、IL-6分泌作用异常。IL-17在体内具有双重作用，一方面IL-17可促进B细胞产生自身抗体[26]，抗-AChR抗体产生即依赖于IL-17，同时分泌IL-17与GM-CSF的T细胞可诱导自身免疫，另一方面，同时分泌IL-17和IL-10的T细胞则具有维持免疫稳态的作用[27]。模型动物中Th17细胞增多伴IL-17上调与发病相关，IL-17可促进AChR特异性T细胞及产抗-AChR B细胞增殖[28]。有研究者结果发现IL-17基因敲除模型动物重症肌无力症状轻于野生型[14]，并且抗IL-6抗体治疗可抑制IL-17基因表达，减轻疾病症状[15]。我院重症肌无力科发现儿童重症肌无力患者治疗后IL-17水平低于治疗前，并与临床症状缓解相关[8]。

IL-21是Th17细胞分泌的重要细胞因子之一，可诱导Th2、Th17和Tfh细胞、B细胞、NK细胞分化，并抑制Th1和Treg细胞分化[14,29]，与自身免疫性疾病密切相关，如活动期狼疮患者血IL-21显著高于健康对照[30]。IL-21可增加CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒作用[29]，降低CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞的抑制作用，通过STAT3信号通路诱导B细胞分化[29]，拮抗Treg细胞对于外周组织的免疫保护作用[31]。IL-21还可促使B细胞产生IL-10，进而诱导免疫耐受[29]。重症肌无力患者的IL-21通路可能存在调节异常，其Tfh细胞通过分泌IL-21促进自身抗体生成，在抗-AChR阳性的MG患者中，IL-21不能像在正常人中那样抑制IL-17A分泌[11]，此外，MuSK阳性MG患者的CD4+T细胞分泌IL-21增加[26]。MG患者血清IFN-γ、IL-17、IL-21要高于健康人，全身型患者血清IL-21高于眼肌型[6]。本研究并未发现重症肌无力患者血IL-21与健康对照存在差异，这可能与IL-21所具有的双重作用有关，也可能与入组人群病情较轻有关。

IL-27在自身免疫性疾病中发挥着重要作用，既往研究提示乙酰胆碱受体抗体阳性的重症肌无力患者血清IL-27显著高于健康对照，而在免疫球蛋白治疗后下降[32]。还有研究进一步分析了不同亚型的重症肌无力患者血清IL-27水平，发现全身型重症肌无力患者血清IL-27水平显著高于眼肌型和健康对照组，胸腺瘤相关重症肌无力患者显著高于无胸腺瘤重症肌无力患者 ，抗-AChR阳性重症肌无力患者显著高于抗-AChR阴性患者，但眼肌型及非胸腺瘤相关重症肌无力患者与健康对照组差异无统计学意义[33]，在该研究中还发现血清IL-27水平与全身型重症肌无力患者的MG-ADLs评分正相关，免疫球蛋白治疗可以显著降低血清IL-27水平[33]。而在另一项研究中，早发病MG患者血清IL-27水平显著高于健康对照，而晚发病MG患者血清IL-27则与健康对照水平相近，并且AChR抗体阳性MG患者血清AChR水平与IL-27正相关[34]。但是本研究中与前述研究不同，未发现重症肌无力患者血清IL-27较健康对照组升高，不同病程及亚型重症肌无力患者血清IL-27差异无统计学意义。这可能是由于重症肌无力患者之间较大的异质性及自身免疫性疾病涉及复杂细胞因子调控所致。IL-27由抗原呈递细胞如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞等分泌，在固有和获得性免疫中发挥着重要的作用，IL-27具有促炎和抗炎双重作用，如其既可通过诱导Th细胞分化促进炎症发展，促进IL-21分泌，诱导Tfh细胞分化并维持其存活[35]，另一方面可抑制Th17细胞功能并诱导IL-10产生[21]，负向调节IL-2、IL-6、IL-27等细胞因子，拮抗IL-6的促炎作用，控制免疫过程，IL-27缺陷小鼠可出现严重的T细胞介导致死性免疫应答，给予IL-27可减轻炎症造成的骨破坏[36]。在胸腺瘤相关的重症肌无力患者中，IL-27可能通过IL-27/IFN-γ调节环形成正反馈调节，导致胸腺滤泡增生[37]，这可能部分解释了重症肌无力患者常伴有胸腺异常的现象。

综上所述，重症肌无力患者可能存在着复杂的免疫调控异常，具有显著的异质性，但包括本研究在内的多数研究提示重症肌无力患者IL-6通路调节异常，并且IL-6细胞因子通路与多种细胞因子相互作用，可能在重症肌无力患者免疫调控发挥着关键的作用，有望成为新的治疗靶点。