苦参碱对放射性肺损伤大鼠氧化应激抑制作用的实验研究

★ 曾财花 方永青 何志坚 侯本超 林倩霞 罗小泉 刘海云（.江西中医药大学 南昌 0004；.南昌大学第一附属医院 南昌 0006；.江西省肿瘤医院 南昌 009）

放疗是治疗胸部肿瘤的方法之一，但在放疗过程中，肺部组织往往会有不同程度的损伤，这严重限制了胸部肿瘤的放疗效果。放射性肺损伤对患者机体健康造成严重危害，至今尚没有理想的治疗方法，所以预防尤为重要［1］。目前，西医治疗最常用方法是糖皮质激素及非类固醇消炎药，但存在巨大副作用，因此并不适合长期预防性管理和使用，并且对放射性纤维化并没有很大的疗效［2］。运用中药治疗放射性肺损伤具有一定的疗效，且毒副作用小。

苦参碱是由豆科植物苦参的干燥根、植株、果实提取的生物碱［3］。在临床上对放射性肺损伤有一定的治疗作用，可提高胸部肿瘤的放疗剂量。胸部肿瘤放疗的过程中会造成肺部炎症的发生，有文献报道炎症因子可以激活氧化应激，导致肺损伤［4］。前期本课题组研究已证实苦参碱可以抑制放疗后病人炎症因子的释放［5］及在不同时间点黄芩苷可以抑制放射性肺损伤大鼠的炎症因子释放［6］。故本实验进一步研究苦参碱对放射性肺损伤大鼠氧化应激的影响，证实苦参碱对放射性肺损伤大鼠氧化应激的抑制作用并探索其可能机制。

1 材料

1.1 试药苦参碱购于吉林益民堂制药有限公司（HPLC法测定纯度>98 %，批号：33020822）;地塞米松购自河北天成药业股份有限公司（批号：H22033003，5 mg/支）；SOD试剂盒（批号：20180121）、MDA试剂盒（批号：20180217）及GSH-PX试剂盒（批号：20180214）均购自南京建成科技有限公司；生理盐水；戊巴比妥钠由武汉培全化学试剂有限公司提供。

1.2 动物清洁级雄性SD大鼠144只,体重（200±20）g,大鼠购于北京维通利华实验动物有限公司,许可证号SCXK（赣）2016-0011,室内温度维持在25～27 ℃，相对湿度维持在50 %～60 %，室内空气良好，正常通风，大鼠分笼每天进行饲料喂养,进水不限,标准饲料喂养4 d左右,无异常者正式选入开始实验。

1.3 仪器微量进样器（德国Eppendorf公司）；BSG-26数显恒温水浴锅（上海博讯公司）；AdventurerTM电子天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；TCL-16G型台式高速离心机（上海市实验仪器总厂）；TECAN酶标仪（奥地利 TECAN公司）；sunriseEL3OlsripReader酶标仪（北京世贸远东科学仪器有限公司）；Varian300C 6 MV-X线直线加速器（Varian医疗系统公司）；550型酶标仪（美国BIO-RAD伯乐）。

2 方法

2.1 药物制备以临床成年人的治疗用量为依据，按大鼠的等效剂量进行折算，地塞米松大鼠用药剂量为5 mg/kg，苦参碱治疗组大鼠用量分别为50、100、200 mg/kg。另用适量生理盐水将其配置成悬浮液，充分搅拌，混匀，现配现用。

2.2 实验动物分组及给药选取144只健康SD大鼠，根据随机数字表法分为6组，随机分配为正常对照组、模型组（单纯照射组）、地塞米松组及苦参碱低、中、高浓度（50、100、200 mg/kg）给药组，每组24只，正常组不予照射，其余组均进行X线照射，照射后苦参碱和地塞米松用生理盐水配置为悬浮液，苦参碱低、中、高浓度组灌胃给药，每日1次；正常组和模型组每天同一时间注射相同体积的生理盐水。在照射开始后第2、4、8、12周，6组各任意挑选1只大鼠处死、取样，取标本备用。

2.3 动物模型制备［5］除正常组外，其余组大鼠用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，根据特定排序将其固定于治疗床上，使其呈仰卧位，暴露大鼠胸部，屏蔽头腹部，并将照射视野调整好，照射范围从大鼠前肢两腋窝中点连线，至剑突水平，照射面积为4 cm×3 cm。在照射过程中，空白照射组大鼠不予以照射，其余各组选用直线加速器（6 MV-X线）对实验大鼠整个肺进行一次照射，单次剂量为15 Gy，照射距离为1 m，输出功率为300 cGy/min，总剂量为30 Gy,照射前要用紫外线消毒照射部位。

2.4 标本留取分别在SD大鼠照射结束后第2、4、8、12周时，每组随机选取6只大鼠，麻醉后迅速取除肺组织，称重，然后制备肺组织匀浆，随后将该肺匀浆试管放置于离心机离心，转速3 000 r/min，温度在4 ℃，离心时间10 min，离心结束后吸取上清液制备肺悬液冻存备用。

2.5 血清指标检测按试剂盒的操作要求，利用比色法检测实验大鼠血清中MDA含量、SOD活性和GSH-PX活性。

2.6 统计学方法运用分析软件SPSS 19.0对数据进行统计学处理,实验数据以（±s）表示,各组间采用LSD法对数据两两比较分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠外观形态的观察正常对照组大鼠各项指标检测均正常，具体表现为饮食进水量正常，反应迅速，呼吸频率未产生较大改变，皮毛光泽；而其它组大鼠在照射后开始出现饮食进水量减少，精神萎靡，大便干燥，呼吸频率升高，反应迟缓等症状；单纯照射组大鼠随着照射时间的延长个别大鼠出现活动迟缓的现象；与之相比，苦参碱和地塞米松给药组在给药一段时间后，饮食由差逐渐好转，活动量也有所改善，出现1例大鼠死亡现象。

3.2 各组大鼠肺组织MDA含量变化比较相比于正常对照组，单纯照射组大鼠肺组织MDA含量在辐射后明显升高;相比于单纯照射组,苦参碱低、中、高剂量组和地塞米松激素组大鼠肺组织MDA含量水平均逐渐降低,差异有统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠各时点肺组织MDA含量的变化（ ±s，n=6） nmol/mL

表1 各组大鼠各时点肺组织MDA含量的变化（ ±s，n=6） nmol/mL

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。第12周低剂量组大鼠死亡1只，样本数为5，下同。

组别 2周 4周 8周 12周正常对照组 2.01±0.32 2.12±0.21 2.08±0.18 2.26±1.01模型组 3.02±0.42* 3.42±1.16* 4.12±1.03* 4.86±2.08**地塞米松组 2.18±1.08** 2.25±0.38## 2.48±0.31 2.85±1.46##苦参碱低剂量组 2.84±1.32# 2.91±1.13# 3.16±0.18# 3.78±1.34苦参碱中剂量组 2.61±0.67# 2.74±1.26## 2.82±0.23# 3.41±1.23#苦参碱高剂量组 2.33±0.48## 2.43±1.24## 2.52±0.86# 3.07±2.14##

3.3 各组大鼠肺组织SOD活性变化比较相比于正常对照组，单纯照射组大鼠肺组织SOD活性在辐射后明显降低;相比于单纯照射组,苦参碱低、中、高剂量给药组和地塞米松激素给药组大鼠肺组织SOD活性均逐渐升高。见表2。

表2 各组大鼠各时点肺组织SOD含量的变化（ ±s，n=6） U/mL

表2 各组大鼠各时点肺组织SOD含量的变化（ ±s，n=6） U/mL

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别 2周 4周 8周 12周正常对照组 133.24±11.54 131.48±10.24 135.76±9.45 134.36±10.98模型组 90.12±10.24* 85.32±11.24* 76.63±12.48** 68.56±11.24**地塞米松组 126.65±12.49## 121.13±10.17 115.24±14.64## 112.32±12.32##苦参碱低剂量组 100.12±16.16# 95.57±12.67# 90.98±10.31# 80.72±11.52苦参碱中剂量组 124.56±14.23# 112.34±11.68# 101.65±11.24# 90.64±10.49#苦参碱高剂量组 130.45±9.98## 126.16±14.24# 123.43±9.96## 109.65±12.78##

3.4 各组大鼠肺组织GSH-PX活性变化相比于正常对照组，单纯照射组大鼠肺组织GSH-PX活性在辐射后明显降低;相比于单纯照射组,苦参碱低、中、高剂量给药组和地塞米松激素给药组大鼠肺组织GSH-PX活性均显著升高。见表3。

表3 各组大鼠各时点肺组织GSH-PX含量的变化（ ±s，n=6） U/mL

表3 各组大鼠各时点肺组织GSH-PX含量的变化（ ±s，n=6） U/mL

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别 2周 4周 8周 12周正常对照组 182.76±14.21 180.23±8.32 183.74 ±10.71 181.16±11.98模型组 126.21±13.32* 116.81±9.68* 110.41±12.24* 92.36±13.09**地塞米松组 170.43±11.08# 159.62±12.65## 146.67±14.36## 135.26±12.45##苦参碱低剂量组 134.391±12.35 120.45±10.12# 115.42±11.28# 110.72±13.26苦参碱低剂量组 146.12±12.35# 136.04±8.78## 126.02±13.45# 118.98±10.43#苦参碱低剂量组 158.14±16.48## 147.69±11.47# 138.74 ±11.26# 126.37±12.25##

4 讨论

苦参碱是传统中草药苦参的主要成分,具有清热燥湿功效，目前在临床上主要用于治疗心脏病、病毒性肝炎、抗病毒、抗肿瘤和抗肝纤维化等［8］。目前苦参碱已被证明可以以多种方式来抑制肿瘤细胞的生长。在接受苦参碱联合放疗治疗的肺癌患者中，苦参碱显著提高了其治疗效果［9］, 此外苦参碱已被证明在治疗牛皮癣和湿疹等皮肤病方面具有临床疗效［5,10］。

在胸部肿瘤放射治疗过程中，在治疗肿瘤的同时也会伤及正常肺组织，给正常组织带来一定的不利影响，相关炎症因子会非常活跃，造成肺部炎症的发生［11］，若无法得到及时控制，后期将转变为肺纤维化，前期实验已经证实放射性肺损伤大鼠在不同时间点炎症因子有所增加［3］。目前对于放射性肺损伤的机理尚不完全清楚，临床研究证实，肺在受照射后引起炎症反应进一步激活氧化应激，产生氧自由基，而自由基是一种有毒物质，它可以攻击细胞中的大分子物质，引起细胞内各种各样的反应，如DNA的损伤、氧化应激、细胞衰老甚至凋亡等［12］。

SOD是反映机体氧化应激的一项重要指标，SOD在体内不仅起着清除机体内超氧阴离子自由基（O2-），抑制体内自由基反应的作用，另外对其它抗氧化酶也可起到保护作用，减弱辐射对肺组织细胞造成的损伤［13］。经放射线照射后，SOD的活性降低, 不仅会使氧自由基堆积, 而且氧自由基会转变为羟自由基,会更大程度地损伤细胞膜的结构和功能［14］。因此可以通过各组大鼠SOD的活力测定间接反映所用药物对SOD活性的影响，体现药物对肺损伤大鼠的氧化应激抑制作用。本实验研究结果表明，辐射引起大鼠肺组织产生大量自由基，SOD活性降低。与之相比，苦参碱给药组SOD活性明显增强，表明苦参碱有减弱肺部炎症发生和预防肺纤维化的疗效，从而达到抑制放射性肺损伤的作用。

MDA也是反映人体氧化损伤程度的指标之一。人体组织细胞在受到自由基攻击时，会发生脂质过氧化反应，MDA是脂质过氧化的最终产物。因此MDA含量的变化间接反映了人体组织细胞脂质过氧化的严重程度［15］，通过MDA含量的测定可以体现所用药物对肺损伤大鼠脂质过氧化的影响。在本实验中，单纯照射组经射线照射后MDA含量上升，给药后，MDA含量与单纯照射组相比已明显下降，说明中药苦参碱具有抑制脂质过氧化的能力。

GSH-PX是一种存在于机体中的酶，它可催化过氧化氢的分解。GSH-PX可以在体内捕获自由基, 催化还原型谷胱甘肽对氢过氧化物的还原反应, 能够对细胞结构和功能有一定的保护作用［16］。本实验观察到，单纯照射组大鼠经射线照射后GSH-PX活性降低，而苦参碱给药组GSH-PX活性与模型组相比有了明显地增加，揭示苦参碱能够升高GSHPX活性，减弱自由基的过氧化反应。

综上所述，本实验结果显示，单纯照射组经射线照射后MDA含量升高，SOD、GSH-PX活性降低；而经苦参碱治疗后，血清中MDA含量有所降低，SOD、GSH-PX活性升高，表明苦参碱可以提高肺组织细胞中抗氧化酶的活性, 阻断自由基的反应，证明中药苦参碱对放射性肺损伤有一定的疗效，其作用机制可能是减弱自由基反应和抑制脂质过氧化，为苦参碱的临床应用和肺损伤的防治提供了依据。