HPLC法测定阿奇霉素胶囊中阿奇霉素的含量

★ 黎艳刚 李丽云 丁江生 罗小泉 杨武亮（.云南白药集团创新研发中心/云南省药物研究所/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室 昆明 650；．江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

阿奇霉素为第二代大环内酯类抗生素，主要用于治疗呼吸道及生殖道感染。可治疗多种病原体引起的儿童及成人的呼吸道感染，生殖道沙眼衣原体感染等，并被多个国家和地区的医学指南推荐作为上述感染的一线治疗药物［1-3］。原国家食品药品监督管理总局（CFDA）2016年5月26号发布了《总局关于落实《国务院办公厅关于开展仿制药质量与疗效一致性评价的意见》有关事项公告（2016年第106号）》，其中确规定阿奇霉素胶囊应在2018年底完成一致性评价。CFDA在2016年8月17号发布了《关于2018年底前须仿制药质量与疗效完成一致性评价品种批准文号信息》中阿奇霉素胶囊数量共有41个，品种规格为0.25 g（25万单位）。CFDA在2017年4月28号发布了《总局关于发布仿制药参比制剂目录（第三批）的通告（2017年第65号）》中将原研进口普利瓦制药公司生产的阿奇霉素胶囊作为参比制剂。此次一致性评价工作不仅要疗效一致，还要质量一致，本文通过对中国药典［4］、欧洲药典、进口注册标准［5］所收载的阿奇霉素胶囊的含量测定方法进行了对比，发现中国药典方法出峰时间长，欧洲药典方法和进口注册标准方法一致，出峰时间适中，重现性好，选择进口注册标准方法进行方法学验证，并对参比制剂进行含量测定。

1 仪器和试药

Waters e2695 高效液相色谱仪，赛多利斯 CPA 225D电子天平，梅特勒 DELTA 320型pH计。阿奇霉素胶囊，克罗地亚普利瓦制药公司生产，批号为106066、950056、951056；阿奇霉素对照品购于中国食品药品检定研究院，批号为130593-201303，纯度为94.4 %；乙腈为色谱纯，水为纯化水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件采用Shodex Asahipak ODP-50 4D色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾6.7 g，加水1 000 mL使溶解，混匀）-乙腈（40∶60），用10 mol/L氧化钾溶液调节pH值至（11.0±0.1）为流动相。流速为1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；检测波长为210 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 稀释剂A以磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钾6.7 g，加水1 000 mL使溶解，混匀）-乙腈（40∶60），用磷酸调节pH值至8.0。

2.2.2 对照品溶液取阿奇霉素对照品约25 mg，精密称定，至50 mL容量瓶中，加乙腈2 mL，充分振摇使溶解，再加入稀释剂A稀释至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液精密称取阿奇霉素胶囊内容物适量（相当于阿奇霉素50 mg），置100 mL量瓶中，加乙腈2 mL，充分振摇使溶解，再加稀释剂A稀释至刻度线，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.4 空白辅料溶液取空白辅料适量（约相当于阿奇霉素50 mg），置100 mL量瓶中，加乙腈2 mL，再加稀释剂A稀释至刻度线，充分振摇使溶解，过滤，取续滤液作为空白辅料溶液。

2.2.5 系统适用性溶液取阿奇霉素和阿奇霉素杂质A对照品各约5 mg，置10 mL容量瓶中，加乙腈0.5 mL，充分振摇使溶解，再加入稀释剂A稀释至刻度线。摇匀，作为系统适用性溶液。

2.3 专属性试验精密量取上述对照品溶液、供试品溶液、空白辅料溶液及系统适用性溶液各10 μL。分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1-4。测定结果表明空白辅料不干扰本品含量的测定，杂质A与阿奇霉素分离度大于2 %，方法的专属性良好。

图1 专属性图谱

2.4 线性关系考察精密称取阿奇霉素对照品约25 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈2 mL，充分振摇使溶解，再加入稀释剂A稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。取对照品储备液，用稀释剂A稀释制成不同浓度的对照品溶液，精密量取上述各对照品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品的浓度X（µg/mL）为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程和相关系数r。见表1。

表1 线性关系考察试验结果

2.5 精密度

2.5.1 仪器精密度精密量取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图，以主峰峰面积的RSD为指标考察仪器精密度。结果对照品溶液主峰峰面积的RSD值为0.13%，说明该方法的仪器精密度良好。

2.5.2 重复性取阿奇霉素胶囊内容物适量6份，每份约65 mg，按“2.2.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液；按上述色谱条件进行测定，计算含量，结果阿奇霉素的平均含量100.95，RSD为0.39 %；表明重复性良好。

2.5.3 中间精密度取阿奇霉素胶囊内容物适量12份，每份约65 mg，按“2.2.3”项下供试品制备方法制备供试品溶液；按上述色谱条件进行测定，计算含量，其中第一天的数据为引用重复性项下的结果，第二天的数据由不同的人、不同的仪器完成，结果12份阿奇霉素样品的平均含量99.88，RSD为0.61 %，表明本法中间精密度好。

2.6 溶液稳定性取供试品溶液于室温条件下放置0、4、8、12、16、20、24 h，精密量取上述样品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，考察峰面积的变化情况。供试品溶液中主峰峰面积的RSD为0.88 %，结果表明供试品溶液于室温放置24 h内稳定。

2.7 准确度精密称取阿奇霉素对照品约50 mg，置25 mL量瓶中，加入乙腈2 mL，充分振摇使溶解，再加入稀释剂A稀释至刻度，摇匀，作为阿奇霉素对照品贮备液。取空白辅料约150 mg，置1 000 mL量瓶中，加稀释剂A至刻度，摇匀，作为空白辅料溶液。取9个10 mL容量瓶，分成低、中、高浓度3组（80 %、100 %、120 %），每组各3份，低浓度组每份各加贮备液2 mL、中浓度组每份各加贮备液2.5 mL、高浓度组每份各加贮备液3 mL；再依次加空白辅料溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为80 %、100 %、120 %的供试品溶液。另精密称取阿奇霉素对照品约25 mg置50 mL容量瓶中，加入乙腈2 mL，充分振摇使溶解，再加入稀释剂A稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算每份供试品的含量，并计算3种不同浓度溶液的回收率。结果表明，本品9份样品的平均回收率为99.85 %，RSD值为0.84 %，该测定方法回收率良好。见表2。

表2 回收率试验结果

2.8 耐用性试验通过改变流动相比例、流速、柱温、不同批号不同厂家的色谱柱对拟定的色谱条件进行耐用性考察。精密量取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明当柱温变动±5 ℃、流速变动±10 %、流动相的比例变动±2 %、改变色谱柱时，含量结果均符合规定，说明本法对柱温、流速、流动相的比例、色谱柱的耐用性良好。

2.9 样品含量测定分别取上述三批阿奇霉素胶囊内容物约65 mg，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以外标法计算含量。见表3。

表3 含量测定结果 %

3 讨论

本实验对中国药典、欧洲药典及进口注册标准的含量测定方法进行对比，结果发现进口注册标准中阿奇霉素的出峰时间适中，对称因子、分离度、柱效均符合要求，最后选择了进口注册标准的方法作为本品含量测定方法。本文还考察了不同溶剂对供试品溶液的影响，结果显示，乙腈/稀释剂A作为供试品的处理方法效果较好。