UPLC-MS/MS法同时测定三叶青中13种黄酮类成分的含量

★ 李春华 袁桂平 王诚远 何倌发 陈俊（.抚州市食品药品检验所 江西 抚州 44000；.江西省药品检验检测研究院 南昌 009；.江西共青江中食疗科技有限公司 江西 共青城 00）

三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et.Gilg）的块根，又名蛇附子、石老鼠等［1-2］。主要分布于我国江西、浙江、福建等南方各省，生山坡灌丛、山谷、溪边林下岩石缝中，具有解毒、化痰、活血散瘀、护肝、抑制肿瘤细胞等作用［2-8］。其在江西民间有着广泛的应用。

不同产地的三叶青黄酮类成分含量的测定方法已有报道［9-16］，但是同时测定三叶青中13种黄酮类成分较为少见。本实验应用UPLC-MS/MS法同时对三叶青中13种黄酮类化合物进行定量研究摸索，以期为三叶青的质量控制及开发利用提供一定的参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器Nexera X2 LC-30A超高效液相色谱（日本岛津公司）；TRIPLE QUAD 5500三重四级杆质谱（美国AB SCIEX公司）；BP-211D十万分之一天平（德国赛多利斯公司）；DZKW-S-4电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 材料对照品信息见表1。乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，水为Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)，其他试剂为分析纯。8批三叶青样品于2018年8月—2018年10月采自江西分宜、玉山、万载、黎川、资溪和浙江衢州等地，经江西省药品检验检测研究院袁桂平主任药师鉴定为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et.Gilg），腊叶样本存放于抚州市食品药品检验所资料室。2批购自云南。见表2。

表1 对照品信息

表2 三叶青样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～0.5 min，8 %→10 %A；0.5～2.5 min，10 %→15 %A；2.5～3.5 min，15 %→18 %A；3.5～6.5 min，18 %→20 %A；6.5～8.0 min，20 %→22 %A；8.0～10 min，22 %→40 %A；10～11 min，40 %→60 %A；11～12 min，60 %→60 %A；12～13 min，60 %→8 %A；13～15 min，8 %→8 %A）；参数：进样量为1 μL; 流速为0.25 mL/min；柱温为40 ℃。

2.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源，MRM模式进行定量分析；采用负离子检测模式；离子喷雾电压为4 500 V；离子源温度为550 ℃；雾化气、辅助气和气帘气压力分别为55、55、35 units。多反应监测模式定量。监测成分离子对，解簇电压（DP）和碰撞能量（CE）见表3。混合对照品及三叶青样品的总离子流图见图1。

图1 混合对照品溶液（A）及三叶青供试品溶液（B）的总离子流图

表3 三叶青中13种成分的质谱参数

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液分别精密称取表1中所述对照品适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，分别制成质量浓度分别为0.100 2、0.102 7、0.105 7、0.112 6、0.100 2、0.115 5、0.105 4、0.105 1、0.090 6、0.095 3、0.105 9、0.101 8、0.110 3 mg/mL的对照品储备液。其他不同质量浓度的对照品溶液用60 %甲醇稀释储备液得到。

2.3.2 样品溶液三叶青药材粉碎后过筛；精密称取0.5 g，加入60 %甲醇50 mL，加热回流45 min，再用同等浓度的甲醇补足减失重，摇匀，滤过得滤液，取滤液适量，用同等浓度的甲醇稀释25倍，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系相关回归方程、相关系数、定量 限（LOQ）、检测限（LOD）等见表4。

表4 13种成分线性关系 ng/mL

2.4.2 重复性试验精密吸取同一混合对照品溶液1 μL，连续进样6次，记录峰面积。原花青素B1、儿茶素、原花青素B2、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的峰面积RSD值分别为1.30 %、2.29 %、2.04 %、1.99 %、1.51 %、1.21 %、1.88 %、0.51 %、1.91 %、1.41 %、2.51 %、1.84 %、1.52 %。

2.4.3 稳定性试验取相同的三叶青供试品（S1）按2.3.2项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、10、24 h依法测定。计算得到供试品中原花青素B1、儿茶素、原花青素B2、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量RSD值分别为0.72 %、1.63 %、1.77 %、0.75 %、2.14 %、0.67 %、2.50 %、0.63 %、0.47 %、0.24 %、2.32 %、1.61 %、0.45 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验取相同的三叶青供试品（S1）按2.3.2项下方法平行制备6份供试品溶液，依法测定。计算得到供试品中原花青素B1、儿茶素、原花青素B2、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量RSD值分别为0.91 %、2.41 %、2.67 %、2.40 %、1.66 %、1.68 %、1.08 %、1.38 %、1.24 %、1.05 %、1.41 %、0.96 %、0.83 %，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收试验精密称取已知含量的三叶青供试品（S4）约0.25 g，共取9份，分别精密加入三个浓度梯度的对照品，按“2.3.2”项下方法，每个浓度平行制备3份加样回收溶液，依法测定，计算得到13中成分的平均加样回收率为95.84 %～107.38 %，RSD为0.84 %～2.65 %，表明方法回收率良好。

2.5 样品含量测定取10批三叶青样品，按“2.3.2”项方法平行制备样品溶液，按确定的色谱条件和质谱条件进行测定，按外标法，计算各样品中原花青素B1、儿茶素、原花青素B2、芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素的含量。见表5。

表5 10批三叶青中13种成分的含量测定结果 μg/g

3 讨论

本实验中考察了水、不同浓度甲醇作为提取溶剂和提取时间对三叶青黄酮提取效果的比较，结果表明，60 %甲醇作为溶剂，加热回流提取45 min，所测成分含量较高。同时对不同流动相进行了考察（乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1 %甲酸水、乙腈- 0.1 %甲酸水、甲醇-0.1 %醋酸铵水、乙腈-0.1 %醋酸铵水等），发现以乙腈-0.1 %甲酸水作为流动相进行梯度洗脱时，所测成分峰型对称、出峰时间稳定、重复性好。

本实验采用液质联用技术同时测定三叶青中13种黄酮类成分的含量，许文等［10］采用内标法同时测定三叶青中10种黄酮类成分，而本实验采用外标法测定，通过Manual Tuning 针对13种黄酮类成分质谱参数进行优化，先在负离子模式下确定母离子，再子离子、碰撞能量和出簇电压进行优化，使每种成分的母离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最佳。质谱与液相色谱连接后，对离子源温度、雾化气压力、辅助气压力、气帘气压力进行优化，使13种黄酮类化合物的离子化效率最佳。对手性异构体原花青素B1和原花青素B2分别选择最佳定量离子对577.2→289.1和577.2→406.9以减少相互之间的干扰。通过流动相梯度的优化，在15 min内实现了13种化合物在色谱上基本分离，在13种化合物的质谱通道上均基线完全分离互不干扰。

对于10批三叶青含量测定的结果表明，不同产地三叶青中13种黄酮含量有差异，与范世明等［9］、许文等［10］研究结果一致，有的批次中，未检出槲皮苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷。13种黄酮类成分含量在不同产地三叶青药材中存在较大差异，其中S6的原花青素B1最高，其余9批的儿茶素最高；S2的丁香亭-3-O-葡萄糖苷最低，S8紫云英苷最低，其余8批以槲皮苷最低。总黄酮含量S4最高，S7最低。

收集的样品来自不同的种源，江西玉山县繁育基地收集了多地的品种，江西万载县和分宜县种植基地系购买江西玉山县繁育基地幼苗，江西黎川县种植基地系利用本地野生三叶青育苗、种植，浙江衢州在浙江本地苗圃购幼苗。收集的样品生长环境也差别比较大，江西玉山县为大棚种植，江西万载县、黎川县和分宜县为坡地露天种植，浙江为林下种植和太阳能板遮阳营养袋种植。不同产地三叶青样品中13种黄酮含量差异悬殊,可能与各种植基地三叶青引种来源不一致和不同生态环境有关。据文献报道，不同产地三叶青样品中黄酮含量差异悬殊,许文等［10］检测30批三叶青根黄酮类成分含量为203～2 591 μg/g。不同种源三叶崖爬藤的表型性状存在丰富的变异，三叶崖爬藤块茎中总黄酮也存在变异，窄叶的总黄酮含量比阔叶高77.53 %［17］。自然环境的时空异质性会导致不同的选择压力，处于不同环境的种源则可能在次生代谢产物方面产生分化［18-19］。不同种质之间三叶青进行统一人工栽培后，产量、有效成分并不相同［19］，块茎中总黄酮和多糖含量与茎粗、新稍长、叶长、叶宽、单叶面积、块茎直径和单株块茎鲜质量总体上呈极显著负相关［19］，同时三叶青块茎总黄酮含量随着生长年限的增长而不断上升［20］。

本实验建立了超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法测定三叶青中13种黄酮类化合物的含量测定，该分析方法简便可行、快速准确，可为三叶青中黄酮成分的分析和质量控制提供一定的参考。