基于网络药理学探讨“白术-白芍”药对治疗溃疡性结肠炎的作用机制

★ 王艳茹 安明伟 唐勇 汤卢伟 易思彬 付文强（.江西中医药大学 南昌 330004；.江西省中医院 南昌 330006）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种比较特殊的肠道炎性疾病［1-2］，其病因已排除细菌及病毒的感染，目前研究更倾向于属于免疫系统疾病［3-4］，是外源物、基因和免疫力相互作用的结果。病理主要表现为糜烂及溃疡的持续性进展［5］。根据流行病学调查，遗传、种族、免疫、心理等因素都会影响UC的发病和进展［3,6-7］，其临床表现严重影响患者的工作及生活，如果不积极治疗，容易引发并发症，而且存在恶变的可能性。

目前，UC的发病机制并不明确［8-9］，临床上治疗方案多以PAS制剂、抗菌药物、激素治疗、生物制剂、益生菌制剂、肠道粪菌移植等［10-12］，再加上部分药物保留灌肠治疗［13］，患者症状确有改善，但终究达不到根治的目的，且部分治疗方案价格昂贵，所需药物成分不易提取，服用后副作用大，后期复发率高。因此，寻求一种安全可靠、物美价廉的治疗方法成为了当代的需求。

UC症状与中医学中的“泄泻”“痢疾”“肠澼”及“脏毒”等疾病的症状极其相似［6,14-15］。说明中医在UC治疗方面经验丰富。不管在古代医案中，还是在临床和学术研究上，经典名方—痛泻要方均被提及且应用频率颇高。《医方集解》在对痛泻要方进行方解时以“苦燥湿”“补脾温中”“泻肝火”和“缓中止痛”的阐述，说明“白术-白芍”作为该方的君药和臣药，在方中的补脾柔肝、祛湿止泻的功效中起到关键作用［15-17］；《保命集》对于太阴病泻痢不止的患者，主张用芍药和白术来进行保命治疗，强调了此病的凶险和棘手，同时指明了此病的诊治方向和体现两味中药联合使用的价值［18］。中药方剂中，把“白术-白芍”药对作为核心地位的有朱丹溪的痛泻要方、李杲的当归芍药汤、还有张景岳的调胃白术散等，以上方剂主治相似，在调和肝脾的基础上进行随症加减和变通。目前，“白术-白芍”药对被广泛运用于UC与肠易激综合征的临床治疗中［19-21］，且疗效显著。为进一步明确该药对治疗UC的作用机制，本文在网络药理学的基础上，筛选出“白术-白芍”的有效活性成分及作用靶点，并构建“药物-成分-基因-疾病”可视化网络图，实现药物有效成分与疾病基因的有效对接，为中医药在UC治疗作用中提供依据。

1 资料与方法

1.1 “白术-白芍”药对有效成分的筛选及作用靶点的获取进入中药系统药理学技术（TCMSP数据库）平台,自定义生物利用度≥30 %，类药性指数≥0.18为筛选条件［22-23］，分别筛选出白术、白芍的有效活性成分，构建“白术-白芍”数据库，并进一步利用该平台得到药物相关有效成分的作用靶点，构建靶点数据库。

1.2 疾病靶点筛选以“ulcerative colitis”为关键词 ，运用 Genecards数据库、人类基因和基因表型综合数据库（OMIM）获取疾病“溃疡性结肠炎”的相关靶点。

1.3 可视化网络图的构建与分析运用Cytoscape 3.7.2软件，将“白术-白芍”的有效成分的靶点与疾病的靶点进行匹配。以药物-疾病共有活性成分、成分对应基因、Ulcerative colitis相关靶点、药物主要成分共四个节点建立对应的关系，并导入 Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-基因-疾病”可视化网络关系图。

1.4 “白术-白芍”药对治疗UC的蛋白互作网络构建将“Drug-Disease”基因上传 STRING 数据库，将organism局限于Homo sapiens,进一步构建蛋白相互作用网络图（PPI），并隐藏脱落的基因。

1.5 生物学过程和信号通路富集分析在GO和KEGG富集分析下，描述基因功能及获得显著富集的信号通路，从而进一步探讨“白术-白芍”药对治疗UC的生物学过程及主要的信号通路。

2 结果

2.1 药物活性成分、靶点及基因的转化通过利用TCMSP数据库，搜寻“baizhu”“baishao”有效成分共141个，添加自定义筛选条件后，共获取符合条件的有效成分20个。见表1。在该数据库中获取“baizhu”“baishao”相关靶点共1 764个；利用Strawberry-perl软件，对有效成分及药对靶点进行匹配，并筛除重复靶点后得到146个靶点；把成分对应的靶点名称转化为相对应的基因简称共113个，形成药物基因数据库。见表2。

表1 白术、白芍活性成分

表2 白术、白芍基因简称数据库

2.2 疾病靶点数据库的建立 在Genecards及OMIM数据库中搜集UC的疾病靶点共4 165个，在R 3.6.2运行帮助下，把“baizhu-baishao”靶点数据库与疾病靶点数据库中Gene Symbo进行匹配，并制作venny图寻找共同基因，药对疾病共44个。见图1。

图1 药物-疾病共有作用靶点

2.3 白术-白芍药对“药物-成分-基因-疾病”可视化运用Cytoscape 3.7.2软件，将“白术-白芍”的有效成分的靶点与疾病的靶点进行匹配，构建“药物-成分-基因-疾病”可视化网络关系图，绿色三角形表示药对-疾病共有的44个靶点，大红色菱形表示疾病UC，玫红色的椭圆表示药对“色的椭圆表示药对对对疾病点进行，9个黄色的菱形表示药物的主要有效成分，内部的线段表示相互之间的关系。由此可以看出“白术-白芍”药对对疾病UC的治疗具有多靶点、多成分的特点。见图2。

图2 药物-成分-基因-疾病可视化网络图

2.4 具白术-白芍”药对治疗溃疡性结肠炎蛋白互作网络将“Drug-Disease”基因上传STRING数据库，将organism局限于Homo sapiens,进一步构建蛋白相互作用PPI网络图。见图3。可知共有44个共有靶点的蛋白，未有脱落的游离蛋白，再根据44个靶点的蛋白的count值，由大到小进行排序。见图4。

图3 蛋白互作网络图（PPI 网络）

2.5 生物学GO和KEGG富集分析在GO富集分析下可知共有74个GO生物学过程，截取前20个GO条目，制成柱状图和气泡图。见图5-6。可知药物活性成分产生作用与血红素、四吡咯、肽、酰胺等结合、氧化还原酶活性等相关。

图5 GO富集分析（柱状图）

图6 GO富集分析（气泡图）

在KEGG通路富集分析下可得到121条通路。截取前20个KEGG通路，制成柱状图、气泡图和通路图，见图7-9。可知药对中的主要成分参与AGE-RAGE、TNF、Toll样受体、IL-17、C型凝集素受体、NF-素受、PI3K-Akt、NOD样受体和MAPK等多条信号通路，且与乙型肝炎、结核、麻疹、甲型流感及各种病毒感染等相关，说明药对的主要成分可以直接或通过121信号通路间接作用于UC的相关受体靶点，而且与多种疾病相关，在其它疾病的治疗当中本药对也具有研究价值。

图7 KEGG富集分析（柱状图）

3 讨论

《内经》中“肠澼”注重对大便的观察，认为该病所排大便质黏滑，排便时因泄泻辟辟作响［24］；《医学发明》强调气滞致痛，利则气顺痛减；《千金要方·热痢》认为冷痢见脓白便，热痢见血红便，疳痢见脓血赤白便，蛊痢见纯瘀血便；《医方考》认为痢疾病因在湿热，热伤血下赤，热伤肠道，里急后重感明显。综上所述，不管是“肠澼”，还是痢疾，从其描述的症状分析，与西医学的UC归属于同一种疾病，且中医学对于疾病病因及发病机制有较多研究。

图8 KEGG富集分析（气泡图）

图9 KEGG通路富集分析

对于本病的治疗，中医体现了自身的优势，其中运用最为广泛的当属中药，不管是内服还是灌肠，都能起到很好的对疾病的控制和治疗作用。白术-白芍作为补脾柔肝、祛湿止泻的经典药对，在组方中使用频率很高。现代药理研究表明白术在胃肠道领域应用广泛，不仅能影响胃肠动力、抗溃疡保护胃肠黏膜、增强人体免疫功能［9,25］，还具有保肝、利尿、抗应激、抗氧化等多种功能［26-27］。白芍同样具有抗炎抗菌、抑制胃酸、调节机体免疫系统等作用［28］。白术-白芍应既能对症抗炎抗感染，改善肠内环境，又能增强人体免疫功能，起到治标固本的作用。因此本研究利用网络药理学，剖析白术-白芍的作用靶点，并寻找其作用通路，为该药对治疗UC提供数据支撑。

本研究发现：“白术-白芍”药对中成分较多，起主要治疗作用有：（3S,5R,8R,9R,10S,14S）-3,17-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahydro-1H-cyclopenta［a］phenanthrene-15,16-dione（甜菊糖）、paeoniflorin（芍 药 苷）、beta-sitosterol（β-谷 甾醇）、sitosterol（谷甾醇）［10］、kaempferol（山奈酚）、（+）-catechin［（+）-儿 茶 素 ］、14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol［14-乙酰基-12-酰基-8-顺式折术三醇甘草黄酮（多炔类化合物）］、3β-acetoxyatractylone（3β-乙酰氧基苍术酮）和8β-ethoxy atractylenolide Ⅲ（8β-乙氧基白术内酯Ⅲ）。查阅相关资料发现，因甜菊糖具有促进新陈代谢、降血压和治疗胃酸过多的功能［29-31］，临床上可用于高血压、胃炎等疾病的控制和治疗。芍药苷常作为心血管用药保护心肌细胞［32］，此外还具有抗炎、抗溃疡、调节免疫力等药理作用［33-34］。近年来，芍药苷还被运用于胃肠道的炎症治疗［35］，如可通过TNF信号通路，减少机体白细胞来减轻炎症反应，来保护胃肠黏膜。β号谷甾醇作为谷甾醇的一种［36］，因其具有很好的降胆固醇作用，被广泛运用于高脂血症［37］；此外，药理学研究还发现具有止咳、抑制肿瘤和修复组织的作用，因此可用于呼吸道疾病和皮肤粘膜的修复。山奈酚用于肿瘤的预防和治疗最为常见［38］，此外还可以抗炎抗氧化［39］，对于溃疡面有很好的保护和抑菌作用，（+）-儿茶素经小鼠等实验被证实具有调节抗凋亡蛋白、化学预防、抑制环氧酶活性及延迟肿瘤等作用，并广泛运用于临床，如预防人类前列腺癌等。多乙酰氧基苍术酮和8酰氧乙氧基白术内酯Ⅲ作为白术挥发油的组成成分，具有抑菌抗炎、抗氧化及提高人体免疫力等作用。综上所述，9种有效成分自身均具有特定的功效，对于UC疾病的治疗具有多靶点、多途径、多成分、多层次的特点，但在中药特色剂型高温煎煮的物理及化学作用下，汤剂成分表现为多样性和复杂性。

从“白术-白芍”药对治疗UC蛋白互作网络结果来看，IL6、AKT1、JUN、MAPK8、PTGS2等都是该药对治疗UC的关键靶点。IL-6属于多效细胞因子，其表达的主要激活因子是IL-1b和肿瘤坏死因子［40］，而以上三种因子都属于炎症因子，参与炎症和疼痛反应。此外，IL6的形成还可以通过其他途径，比如药对中的成分通过Toll样受体信号通路刺激单核细胞和巨噬细胞，从而产生大量的IL6，而其可作为急性炎症反应中的敏感指标。从KEGG信号通路图分析可知，AKT1通过PI3KAkt信号通路参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的生物学过程，发挥新陈代谢的作用［41］；MAPK8通过MAPK信号通路发挥抑制疼痛的作用；PTGS2与肿瘤的生成相关，该因子的启动，与NF-的生、NF-IL-6结合点位有关［42］。

通过对74个GO生物学过程和121条KEGG信号通路分析发现，“白术-白芍”药对治疗UC主要体现在参与炎症和疼痛反应、氧化还原反应、调节胃肠道运动、抗溃疡和增强机体免疫功能，同时与AGE-RAGE、TNF、Toll样受体、IL-17、C型凝集素受体、NF-素受和PI3K-Akt等多条信号通路有关。研究表明，AGE与RAGE是糖尿病肾病发生发展的重要环节［43-44］，能够激活NF-激活等因子，发挥氧化应激反应；二者在相互作用的同时可以激活PI3K-Akt信号通路。张涛等［45］在观察UC相关癌性小鼠的过程中发现，该信号通路可以介导CDK1表达，诱导炎性缓解，达到修复黏膜的作用。而在本研究过程中，AGE-RAGE、PI3KAkt信号通路在治疗UC过程中占有重要地位，因此，有较大的可能认为此两条信号通路治疗UC的作用机制与氧化应激、肿瘤相关。Toll样受体属于天然免疫，本身及其信号通路与抗感染免疫相关，主要体现在与巨噬细胞和中性粒细胞等结合，产生炎症效应，并产生大量炎症介质，如IL-6，TNF-a等；激活DCs，诱导免疫反应。IL-17和NF-17是免疫反应中的关键细胞因子，既参与炎症、免疫反应，又能调控细胞凋亡。研究发现，IL-17、NF-17［6,46］及其诱导产生物、所组建的信号通路在UC、肿瘤、哮喘等多种炎症及免疫问题上发挥重大作用。

通过疾病作用靶点及信号通路探究可知：“白术-白芍”药对的主要成分通过多个信号通路直接或者间接作用于疾病受体靶点，一方面能够抗炎抗感染、调节胃肠道运动、抗溃疡以保护胃肠黏膜来治标；另一方面又能增强机体免疫力来固本，使中药药对治疗相关疾病多了数据支撑，提高了中医中药治病救人的可信度和科学性，为进一步明确“白术-白芍”药对治疗溃疡性结肠炎的作用机制提供一定理论基础。