补肾降脂方调控自噬与胆固醇流出干预ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的机制研究

闫 黎 申定珠

上海中医药大学，上海市中医老年医学研究所，上海 200031

作为心脑血管事件关键病理基础的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS），胆固醇外排是胆固醇逆向转运（reverse cholesterol transport，RCT）的关键步骤，在AS 病理进程中扮演重要角色[1]。肝X 受体α（liver X receptor alpha，LXRα）在RCT 过程中发挥重要作用[2]。RCT 靶点蛋白ATP 结合膜盒转运蛋白A1（ATP-binding membrane cassette transport protein A1，ABCA1）可调节胆固醇外流[3]。激活LXRα/ABCA1 途径可促进RCT、增加胆固醇外排，调节脂质代谢紊乱[4]。自噬是高度保守的自我降解过程，可选择性将脂滴吞噬并递送至溶酶体降解[5]。基于补肾法乃AS 行之有效的临床治则[6]，结合补肾降脂方有效调控高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠脂质代谢紊乱、调控自噬相关蛋白表达的前期工作基础[7-8]，本研究从自噬介导胆固醇流出角度解析补肾降脂方干预治疗AS 的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6 周龄雄性ApoE-/-小鼠与C57BL/6J小鼠，SPF 级，体重（20±3）g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，动物质量合格证号：SCXK（苏）2018-0008，喂饲于上海中医药大学实验动物中心SPF 级动物房。方案通过上海中医药大学实验动物福利与伦理审查（PZSHUTCM200628005）。

1.1.2 药物与试剂 补肾降脂方颗粒由菟丝子、枸杞子、沙苑子、女贞子、覆盆子、黑大豆各10 g 组成（江苏江阴天江药业有限公司，19120222、19100372、19080302、19100472、19110522、19090562）；阿托伐他汀片（辉瑞制药有限公司，DT1537）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（Sigma-Aldrich 公司，M9281）；油红O 染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，G1016）；FILIPIN 染色试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司，GMS80059.3）；总胆固醇（total cholesterol，TC）、游离胆固醇（free cholesterol，FC）试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，E1005、E1006）；兔抗LXRα、鼠抗ABCA1（Abcam 公司，ab176323、ab18180）；兔抗微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）A/B、兔抗p62、兔抗GAPDH（Cell Signaling Technology 公司，4108S、23214S、5174S）。

1.2 分组

100 只6 周龄雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养至8 周，采用随机数字表法将其分为模型组、补肾组、他汀组、3-MA 组，每组25 只，高脂饲料（小鼠常规基础饲料+21%脂肪+0.15%胆固醇）喂饲；25 只同品系、同周龄雄性C57BL/6J 小鼠为正常对照。补肾组、他汀组分别以补肾降脂方水溶液（3842.85 mg/kg）、阿托伐他汀水溶液（2.055 mg/kg）灌胃，0.2 ml/只，每日1 次；3-MA组以3-MA 水溶液腹腔注射（15 mg/kg），隔日1 次[9]；正常组、模型组以等体积蒸馏水灌胃，每日1 次。干预12 周。

1.3 观察指标与检测方法

1.3.1 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色取主动脉连同心脏，10%福尔马林固定，用于HE 染色。脱蜡→苏木精染色→伊红染色→封片，光学显微镜采集图像，Image-Pro Plus 分析主动脉窦斑块面积/管腔总面积。

1.3.2 油红O 染色 取主动脉连同心脏，10%福尔马林固定，用于油红O 染色。切片干燥→异丙醇分化→苏木精复染→盐酸酒精分化→返蓝液返蓝→封片。数字切片扫描仪采集图像，Image-Pro Plus 分析主动脉窦红染脂质面积/管腔总面积。

1.3.3 FILIPIN 染色 取主动脉连同心脏，10%福尔马林固定。按FILIPIN 染色试剂盒说明书操作，荧光显微镜采集图像，Image J 分析阳性区域平均荧光强度。

1.3.4 透射电镜 取主动脉弓处组织，2.5%戊二醛预固定，1%锇酸后固定，梯度酒精脱水，包埋切片，透射电镜观察自噬小体与脂滴。

1.3.5 比色法 眼球摘除取血，离心（12 000 r/min，15 min，4℃；离心半径为10 cm），取上清，按TC、FC 测定试剂盒说明书操作，550 nm 处测光密度（optical density，OD）值，绘制标准曲线；胆固醇酯（cholesterol ester，CE）=TC-FC。

1.3.6 Western blot 取胸主动脉至腹主动脉段，蛋白提取及定量。SDS-PAGE 电泳湿转，室温封闭1.5 h，4℃过夜孵育一抗（LXRα、ABCA1、LC3A/B、p62，1∶1000；GAPDH，1∶2000）。TBST 洗膜，室温孵育二抗（1∶3000）1 h，洗膜后显影。结果以目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值表示。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 或Games-Howell 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组主动脉窦病理形态比较

正常组主动脉窦未见明显AS 斑块（图1A）。模型组AS 斑块面积比大于正常组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；补肾组、他汀组AS 斑块面积比小于模型组，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）；3-MA组AS 斑块面积比大于模型组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；补肾组与他汀组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）（图1B）。

图1 各组主动脉窦HE 染色情况与斑块面积比比较

2.2 各组主动脉窦脂质蓄积比较

正常组主动脉窦未见明显红染脂质（图2）；模型组红染面积大于正常组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；补肾组、他汀组红染面积小于模型组，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）；3-MA 组红染面积大于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；补肾组与他汀组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）（图3）。

图2 各组主动脉窦油红O 染色情况（40×）

图3 各组主动脉窦红染脂质面积比比较

2.3 各组主动脉窦FC 染色情况比较

正常组主动脉窦未见明显蓝色荧光（图4）；模型组主动脉窦阳性染色面积大于正常组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；补肾组、他汀组阳性染色面积小于模型组，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）；3-MA 组阳性染色面积大于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；补肾组与他汀组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）（图5）。

图4 各组主动脉窦FILIPIN 染色情况（200×）

图5 各组主动脉窦阳性染色面积比比较

2.4 各组主动脉自噬小体与脂滴情况

正常组主动脉内皮细胞结构完整，可见自噬小体；模型组主动脉内皮细胞肿胀，可见脂滴，未见自噬小体；补肾组、他汀组主动脉内皮细胞可见自噬小体；3-MA 组主动脉内皮细胞膜破损，细胞核形态不完整，多处可见脂滴，未见自噬小体（图6）。

图6 各组透射电镜情况（20 000×）（黄：脂滴；红：自噬小体）

2.5 各组血清TC、FC、CE 含量比较

模型组TC、FC 及CE 含量高于正常组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；补肾组TC、FC 及CE 低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；他汀组TC、FC 及CE 低于模型组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；3-MA 组TC、CE 高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；补肾组与他汀组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 各组血清TC、FC、CE 含量比较（mmol/L，）

表1 各组血清TC、FC、CE 含量比较（mmol/L，）

注：与正常组比较，aaP ＜0.01；与模型组比较，bP ＜0.05，bbP ＜0.01。TC：总胆固醇；FC：游离胆固醇；CE：胆固醇酯；3-MA：3-甲基腺嘌呤

2.6 各组主动脉LXRα、ABCA1、LC3、p62 蛋白表达比较

模型组LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达低于正常组，p62 表达高于正常组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；补肾组LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达高于模型组，p62 表达低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01）；他汀组LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达高于模型组，p62 表达低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）；3-MA 组LC3Ⅱ/Ⅰ表达低于模型组，p62 表达高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；补肾组与他汀组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图7。

图7 各组主动脉LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62 蛋白表达比较

3 讨论

脂质代谢紊乱是AS 形成的关键病理环节，胆固醇流出为RCT 初始步骤，在AS 病理进程中意义重大[10]。RCT 关键靶蛋白ABCA1 可介导胆固醇向apoA-Ⅰ转运促进脂质外排[11]。激活胆固醇含量的感受器LXRα 上调ABCA1 表达，促进胆固醇流出[9]。ApoE-/-小鼠所致AS 病变与人类AS 病变相似，高脂饮食可加速AS 形成[12]。自噬活性不足或过度均可致AS[13]。自噬小体为自噬的标志性结构，电镜是检测自噬的金标准[14]。3-MA 是广泛应用的自噬抑制剂[15]。自噬发生过程中，LC3-Ⅰ可脂化为LC3-Ⅱ，以LC3-Ⅱ/Ⅰ评估自噬水平：自噬降解底物p62 可反映自噬活性[16]。脂滴可经自噬溶酶体途径降解，即脂滴被自噬小体包裹后与溶酶体融合，甘油三酯与CE 在溶酶体中被酸性脂肪酶水解为FC 与游离脂肪酸，其中FC 外排由ABCA1 介导[17]。激活LXRα/ABCA1 可减少ox-LDL 诱导的VSMCs 脂质蓄积，与诱导自噬有关[18]。在Ac-LDL诱导的THP-1 巨噬细胞泡沫化进程中，FGF21 可通过RACK1 诱导自噬，促进胆固醇流出[19]。本研究显示，与正常组比较，模型组AS 斑块、脂质蓄积、FC 阳性染色面积及脂滴增加，TC、FC、CE 含量及p62 表达升高，自噬小体减少，LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低：较之模型组，3-MA 组斑块、脂质蓄积、FC 阳性染色面积及脂滴增加，TC、CE 含量及p62 表达升高，未见自噬小体，LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低。

根据临床表现，AS 可归属“脉痹”“胸痹”等范畴。本虚标实乃AS 病机之根，肾虚致AS 理论受诸多学者重视。本课题组前期研究证实，AS 与增龄相关，以肾虚为本；补肾降脂方可调控RCT、促进自噬，进而有效干预治疗AS[7-8]；但从自噬与脂质代谢角度探讨补肾方药干预AS 的机制尚待阐明[20]。补肾降脂方由菟丝子、枸杞子、沙苑子、女贞子、覆盆子、黑大豆组成，具补肾益精、降脂利脉之功。菟丝子补肾固精、枸杞子滋肾益精，共为君药：沙苑子补肾助阳、女贞子补肾滋阴、覆盆子益肾固精，共为臣药：黑大豆活血利水解毒为佐使药。本研究显示，补肾降脂方可减少AS 斑块、脂质蓄积、FC 及脂滴，降低TC、FC、CE 含量及p62 表达，增加自噬小体，升高LXRα、ABCA1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达。

综上，补肾降脂方有效干预治疗AS 的作用机制可能与其调控自噬、促进胆固醇流出有关。基于自噬与脂质代谢的相关性，本课题组将结合体内、体外研究，深入解析补肾降脂方有效干预治疗AS 的科学内涵。