乳腺浸润性小叶癌组织中miR-211-5p、SETBP1 的表达及其意义

翁向前 王叶凌 林 冰 张 爽 苏 俊

1.海南医学院第一附属医院放疗科，海南海口 570102；2.海南医学院第一附属医院普外科，海南海口 570102

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，全球每年新发病例约210 万例[1]。乳腺癌中以浸润性小叶癌（infiltrating lobular carcinoma，ILC）最为常见。ILC 患者即使采取积极治疗，治疗后患者的生存预后仍较差，因此有必要探索ILC 新的诊断方法及治疗手段[2]。微RNA（microRNA，miR）是小的RNA 分子，与自身免疫性疾病、肿瘤及心血管疾病等的病理生理学过程密切相关[3-4]。miR-211-5p 基因位于15q13.3，在肾癌[5]、宫颈癌[6]等多种肿瘤中表达下调，发挥抑癌基因的作用。SET 结合蛋白1（SET binding protein 1，SETBP1）基因位于18q12.3，SETBP1 能够结合细胞核内SET 原癌基因，促进细胞增殖。研究发现，SETBP1 在多发骨髓瘤、髓系白血病等恶性肿瘤中异常表达升高，并能够促进肿瘤的恶性进展[7]。研究表明，SETBP1 受到多种miRNA（miR-4319、miR-211-5p 等）的转录后表达调控，肿瘤发生时调控SETBP1 的miRNA 表达异常降低，而SETBP1 表达升高，其共同参与肿瘤细胞的恶性进展[8]，本研究通过分析miR-211-5p、SETBP1 在ILC 患者中的表达，探讨两者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019 年1 月至2020 年9 月海南医学院第一附属医院诊治的82 例女性ILC 患者的临床病理资料。纳入标准：①经组织病理检查确诊为ILC；②首次诊治；③患者对本研究知情同意，能够配合诊治。排除标准：①合并有急性乳腺炎、乳腺脓肿等感染性疾病；②既往有其他恶性肿瘤病史；③合并肺肾等脏器衰竭；④伴有严重心肺功能障碍。年龄30～79 岁，平均（53.1±6.2）岁；肿瘤大小≤2 cm 者39 例，>2 cm 者43 例；伴腋淋巴结转移者31 例，无腋淋巴结转移者51 例；按照2016 年第八版AJCC 乳腺癌TNM 临床分期标准[9]：Ⅰ～Ⅱ期62 例，Ⅲ～Ⅳ期20 例；组织分化程度：高中分化56 例，低分化26 例；孕激素受体（progesterone receptor，PR）阴性34 例，阳性48 例；雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性31 例，阴性51 例；依据免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测结果判断c-erbB2的染色结果，阳性63 例，阴性19 例；三阴乳腺癌18 例，非三阴乳腺癌64 例。

1.2 荧光定量PCR 检测

收集术中新鲜获取的ILC 癌组织及癌旁组织（距离癌组织边缘>2 cm 且经病理学检查明确），置于液氮中冻存。实验时取约50 mg 组织，Trizol 法提取组织中总RNA，分光光度计（上海元析仪器有限公司，B-500 型）测定RNA 溶液的吸光度值，将合格的总RNA 用DEPC 水溶解，-80℃条件下保存。以总RNA为模板，进行反转录，合成cDNA。以cDNA 为模板，进行荧光定量PCR。SYBR Green premix plus 试剂盒购自TAKARA 公司，货号DRR041A。购自miR-211-5p正向引物序列：5’-ACGGGAAAGGTTGAAAGGATT-3’，反向引物序列：5’-GGGAAAGGTTGAAAGGATTGT-3’，内参U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’；SETBP1 正向引物序列：5’-CCAACGCGGACAGTGAGAAAT-3’，反向引物序列：5’-CCTCCTTCGTGGCTTTGCTAT-3’，以GAPDH 为内参，正向引物序列：5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’，反向引物序列：5’-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’。总体系20 μl，其中模板2 μl，聚合酶0.2 μl、上游及下游引物各1 μl、2XSYBR Green Premix 10 μl 及ddH2O 5.8 μl。反应 条件为：94℃2 min，94℃15 s，62℃20 s，70℃10 s，变性退火延伸共35 个循环，每个样本重复3 次。目的基因miR-211-5p、SETBP1 的表达水平分别相对于内参基因U6、DAPDH 的比值为2-ΔΔCt，计算目的基因的相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。Pearson 线性相关分析miR-211-5p 与SETBP1 表达的相关性。采用TargetScan Human7.2 在线软件预测miR-211-5p 与SETBP1 的结合位点。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ILC 癌与癌旁组织中miR-211-5p 与SETBP1 表达差异

ILC 癌组织中miR-211-5p 的相对表达量明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜0.05），而SETBP1的相对表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 ILC 癌与癌旁组织中miR-211-5p 与SETBP1表达水平比较（）

表1 ILC 癌与癌旁组织中miR-211-5p 与SETBP1表达水平比较（）

注：ILC：浸润性小叶癌；miR-211-5p：微小RNA-221-5p；SETBP1：SET 结合蛋白1

2.2 ILC 癌组织中miR-211-5p、SETBP1 表达与临床病理特征的关系

不同年龄、肿瘤大小、组织分化程度、ER 表达、PR 表达、c-erbB2 表达、三阴性表达的癌组织中miR-211-5p、SETBP1 表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。与肿瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期ILC 癌组织比较，肿瘤TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的ILC 癌组织中miR-211-5p 表达显著较低，而SETBP1 的表达显著较高（P ＜0.05）。与无腋淋巴转移ILC 癌组织比较，伴腋淋巴转移的ILC 癌组织中miR-211-5p 表达显著较低，而SETBP1的表达显著较高（P ＜0.05）。见表2。

表2 癌组织中miR-211-5p、SETBP1 表达与临床病理特征的关系（）

表2 癌组织中miR-211-5p、SETBP1 表达与临床病理特征的关系（）

注：ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；miR-211-5p：微小RNA-221-5p；SETBP1：SET 结合蛋白1

2.3 ILC 癌组织中miR-211-5p、SETBP1 表达的相关性

ILC 癌组织中miR-211-5p 的相对表达量与SETBP1 的相对表达量呈显著负相关（r=-0.573，P <0.001）。见图1。

图1 癌组织中miR-211-5p 与SETBP1 相对表达量的相关性

2.4 miR-211-5p 与SETBP1 的结合位点预测

TargetScan Human7.2 在线软件对miR-211-5p与SETBP1 的结合位点进行预测，结果显示SETBP1的3’UTR 区第374 至381 个碱基处存在与miR-211-5p 潜在的互补结合位点。见图2。

图2 TargetScan Human7.2 在线软件预测miR-211-5p与SETBP1 的结合位点

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，我国每年发病例数达16.9 万例，死亡例数达4.5 万例[10-13]。深入研究ILC 发生发展的分子机制，对寻找新的诊断治疗靶点，意义较大。肿瘤的生物学特征包括无限增殖、凋亡抑制、过度肿瘤血管生成、获得浸润和转移能力、免疫逃逸、代谢异常及基因组不稳定和突变。研究表明，肿瘤中存在多种miRNA 异常表达升高或降低的现象，并通过调控肿瘤细胞的增殖、凋亡及转移等恶性行为，影响肿瘤的发生发展过程[14]。

miR-211-5p 基因位于人类15 号染色体，其能够结合下游靶基因信使RNA 的3’非编码区，降低靶基因信使RNA 的稳定性，抑制下游靶基因的蛋白表达[15]。近年来研究发现，miR-211-5p 在肾细胞癌[16]、宫颈癌[17]等肿瘤中均存在表达降低的现象，导致肿瘤细胞过度增殖，凋亡减少。本研究中，ILC 癌组织中miR-211-5p 的相对表达量显著低于癌旁组织。目前miR-211-5p 表达降低的机制尚不清楚，可能与长链非编码RNA 如F11-AS1 等对miR-211-5p 的表达调控异常有关。有研究报道，长链非编码RNA F11-AS1 能够作为分子海绵结合并抑制miR-211-5p 的表达，降低miR-211-5p 的表达水平，进而促进下游癌基因核受体亚家族成员3 的表达，导致肿瘤的恶性进展[18]。本研究结果亦显示，与肿瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期ILC 癌组织比较，肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期的ILC 癌组织中miR-211-5p 表达显著较低（P ＜0.05）。与无腋淋巴转移ILC 癌组织比较，伴腋淋巴转移的ILC 癌组织中miR-211-5p 表达显著较低（P ＜0.05）。提示miR-211-5p 的低表达参与促进ILC 的发生发展。肿瘤细胞的过度增殖及转移潜能是肿瘤的重要特征。有研究发现，miR-211-5p在肿瘤中发挥抑癌基因的作用，miR-211-5p 能够结合癌基因Ezrin 信使RNA 的3’非编码区的结合位点，抑制Ezrin 的表达，过表达miR-211-5p 后，Src 信号通路受到抑制，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力减弱，因此，肿瘤中miR-211-5p 表达水平降低激活肿瘤细胞中Src 信号通路，促进肿瘤的增殖及淋巴转移，导致肿瘤进展[19]。

SETBP1 位于人类18 号染色体，参与个体正常细胞的增殖、分化及发育等生物学过程。近年来有学者报道，SETBP1 作为一种致癌基因，在慢性粒细胞白血病、骨髓瘤等肿瘤中存在异常表达升高的现象，其表达水平升高能够促进肿瘤的发生发展[7]。本研究中，ILC 癌组织中SETBP1 的表达水平亦显著升高，其机制尚不清楚。有学者在白血病中发现，SETBP1 基因的SKI 同源域内有4 个氨基酸突变热点，这些基因位点的突变导致泛素连接酶对底物的识别能力降低，导致泛素连接酶降解SETBP1 的功能丧失，引起SETBP1表达的上调，SETBP1 能够进一步激活Janus 激酶1，促进肿瘤细胞的恶性增殖[20-21]。本研究中，与肿瘤TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期及无液淋巴转移ILC 癌组织比较，肿瘤TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期及伴淋巴结转移患者ILC 癌组织中SETBP1 表达较高，提示SETBP1 的高表达参与促进ILC 的恶性进展。其机制目前尚不清楚，SETBP1 能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞的局部浸润及转移的发生。有学者在肺癌中发现，SETBP1 能够诱导肺肿瘤细胞N-钙黏素及Vimentin 等间质性表达，而上皮性标志如E-钙黏素表达降低，使肿瘤细胞发生上皮间质转换，细胞间黏附能力下降，肿瘤细胞易发生局部浸润及淋巴管侵犯，导致肿瘤分期升高及腋淋巴结转移[22-25]。

本研究中ILC 癌组织中miR-211-5p 与SETBP1表达呈明显负相关，其原因可能是SETBP1 是miR-211-5p 的下游靶基因，SETBP1 的表达受到miR-211-5p 的调控。本研究结果亦显示SETBP1 的3’非编码区的第374 至381 个碱基处存在与miR-211-5p潜在的互补结合位点。因此，miR-211-5p 可能通过结合SETBP1 信使RNA 的3’非编码区，降低SETBP1信使RNA 稳定性，抑制SETBP1 的表达。有研究亦证实，SETBP1 是miR-211-5p 的直接下游靶基因，miR-211-5p 能够通过转录后水平抑制SETBP1 的表达，促进肿瘤增殖、浸润及转移[26-27]。但ILC 中二者的具体作用机制有待深入研究。

综上所述，不同肿瘤TNM 分期及是否伴腋淋巴结转移的ILC 癌组织中miR-211-5p 和SETBP1 表达水平有差异，miR-211-5p 和SETBP1 共同参与ILC的发生发展病理过程。针对miR-211-5p 及SETBP1的调控或上游的调控分子进行特异性靶向治疗，可能是一种新的乳腺癌治疗方式，但仍需多中心、大样本的临床资料深入研究两者的临床意义。