胆胃方对十二指肠食管反流模型大鼠蛋白酶激活受体-2 及E-钙黏蛋白的影响

张 伟 奚肇宏 刘梦茹 邱仁静 田耀洲

1.南京中医药大学附属中西医结合医院消化科，江苏南京 210028；2.南京中医药大学第三临床医学院，江苏南京 210046

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是临床常见疾病，全球基于人群每周至少发作1 次GERD 症状的患病率为13%[1]。对于难治性GERD 目前治疗仍较为棘手，研究显示弱酸或非酸反流与难治性GERD 症状密切相关[2-4]。十二指肠胃食管反流（duodenal gastroesophageal reflux，DGER）或十二指肠食管反流（duodenoesophageal reflux，DER）（潜在的胆汁反流）可能是形成难治性GERD 的因素之一[5]。课题组前期运用胆胃方治疗DGER 肝胃不和证取得较为满意的疗效[6]。本研究观察胆胃方对DER 模型大鼠食管黏膜形态、病理及蛋白酶激活受体-2（protease activated receptor-2，PAR-2）、E-钙黏蛋白表达的影响，以探讨胆胃方治疗DER 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级SD 大鼠，雌雄各半，6 周龄，购自南京大学[生产许可证：SCXK（苏）2018-0008，合格证号：202004471]，于空调下架式分笼饲养，每笼6 只，环境温度20～26℃，湿度50%～60%，光照、黑暗各12 h交替，标准颗粒饲料、灭菌注射用水喂养。已通过南京中医药大学附属中西医结合医院动物伦理审查（AEWC-20171220-26）。

1.2 仪器与试药

胆胃方：柴胡10 g、郁金10 g、香附10 g、枳壳10 g、黄连6 g、吴茱萸3 g 等，由天江制药提供免煎颗粒。枸橼酸莫沙比利片（瑞琪）（江苏豪森药业集团有限公司生产，批号：124200906，5 mg/片）、铝碳酸镁片（达喜）（拜耳医药保健有限公司，批号：JS09356，0.5 g/片）。苏木精染液（719054）、伊红染液（719062），珠海贝索生物技术有限公司；组织固定液（1809330），江苏世泰实验器材有限公司。E-钙黏蛋白抗体（14472S，使用浓度1∶100），Cell Signaling 公 司；PAR-2 抗 体（ab180953，使用浓度1∶100），Abcam 公司。生物组织摊烤片机（型号CT-9），德国Leica 公司；倒置生物显微镜（型号CKX31），日本Olympus 公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与造模 根据随机数字表法将72 只SD 大鼠分为正常组、模型组、西药组和胆胃方低、中、高剂量组，各12 只。6 周龄SD 大鼠分笼饲养1 周以适应环境，自由进食标准颗粒饲料及饮水。术前24 h禁食固体食物，术前6 h 禁水。术后6 h 进水，术后24 h 正常进食。模型组及给药组均采用“贲门缝合+食管十二指肠吻合术”造模[7]：0.3%戊巴比妥钠1 ml/100 g剂量行腹腔注射麻醉，上腹正中切口，进腹后将食管下段分离神经和血管，结扎贲门，切断食管，贲门口结扎并荷包包埋，于距残端约1 cm 处纵行切开十二指肠壁0.5 cm，与食管下端行端侧吻合，将肠管及食管放归原位后逐层缝合关闭腹腔。术后注射400 000 U青霉素，予5%葡萄糖氯化钠溶液饲养3 d 后正常饲养，造模4 周。于第3、4 周末模型组分别麻醉1 只大鼠，取食管组织观察形态及病理学变化，当出现食管黏膜纵行皱襞扭曲、充血水肿、糜烂及光镜下见鳞状上皮明显增生，固有层乳头伸长明显，炎症细胞浸润等表现，证实模型制备成功。

1.3.2 给药 造模成功后，胆胃方低、中、高剂量组分别予胆胃方低、中、高剂量，胆胃方颗粒临用前用蒸馏水配成1.46、2.92、5.84 g/ml 溶液，根据每天成人用药等效量（按70 kg/200 g 人鼠转换系数W=6.25 计算）的1 倍（1.46 g/ml）、2 倍（2.92 g/ml）、4 倍（5.84 g/ml）给药；西药组予枸橼酸莫沙比利、铝碳酸镁，临用前蒸馏水配成0.003 g/ml 混合溶液；模型组予生理盐水灌胃。按1 ml/100 g 剂量灌胃，每日灌胃1 次，共4 周。

1.3.3 标本制备与采集 给药4 周后处死大鼠，取食管下段（含吻合口）行纵行剖开，予甲醛溶液固定、石蜡包埋、组织切片、HE 染色、免疫组化等制作。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 一般情况 观察大鼠的精神状态、鼠毛、活动情况及食欲等。

1.4.2 食管黏膜形态及病理学观察 食管纵行剖开后肉眼观察大体形态改变，并进行反流性食管炎洛杉矶分级[8]及评分：正常（0 分）；A 级（1 分）：食管黏膜有破损，但无融合，病灶长径≤0.5 cm；B 级（2 分）：食管黏膜有破损，但无融合，病灶长径＞0.5 cm；C 级（3 分）：食管黏膜有破损且有融合，范围小于食管周径的75%；D 级（4 分）：食管黏膜有破损且有融合，范围大于等于食管周径的75%。继以10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm 距离连续切片，HE 染色，光学显微镜下专人盲法观察病理改变，并进行病理分级[9]及评分：正常（0 分）；轻度（1 分）：鳞状上皮增生，黏膜固有层乳头延伸，上皮细胞层内炎症细胞浸润；中度（2 分）：鳞状上皮增生，黏膜固有层乳头延伸，上皮细胞层内炎症细胞浸润，黏膜糜烂；重度（3 分）：鳞状上皮增生，黏膜固有层乳头延伸，上皮细胞层内炎症细胞浸润，溃疡形成，伴或不伴Barrett 食管改变。

1.4.3 免疫组化法测定PAR-2、E-钙黏蛋白的表达将食管组织从组织固定液内取出，进行脱水、石蜡包埋、切片。严格按照免疫组化说明书步骤操作，用免疫组化法测定食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白的表达；应用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统，选用阳性区域积分光密度及阳性面积对免疫组化进行统计分析，计算阳性表达的平均光密度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

造模期间，模型组大鼠毛色欠光泽，抓取时易脱落，倦怠喜卧，进食量少；药物干预4 周后，与模型组比较，给药组精神状态较好，行为较活跃，毛色稍光泽，进食量一般。实验过程中正常组大鼠死亡1 只，模型组、西药组各死亡4 只，胆胃方低、中剂量组各死亡3 只，胆胃方高剂量组死亡5 只。

2.2 各组大鼠洛杉矶分级积分及病理分级积分比较

与正常组比较，模型组大鼠洛杉矶分级积分及病理分级积分升高，差异有统计学意义（P <0.05）；与模型组比较，西药组、胆胃方低剂量组大鼠洛杉矶分级积分及病理分级积分降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠洛杉矶分级积分及病理分级积分比较（分，）

表1 各组大鼠洛杉矶分级积分及病理分级积分比较（分，）

注：与正常组比较，aP <0.05；与模型组比较，bP <0.05

2.3 各组大鼠PAR-2、E-钙黏蛋白免疫组化结果

PAR-2、E-钙黏蛋白正常表达于上皮细胞，呈完整的胞膜表达，镜下见棕黄色颗粒状为表达阳性。与正常组比较，模型组阳性颗粒数、面积、密度及颜色强度明显增加。与模型组比较，除胆胃方高剂量组外，其他给药组阳性颗粒数、面积、密度及颜色强度减少。见图1～2。

图1 各组大鼠蛋白酶激活受体-2 免疫组化结果（400×）

图2 各组大鼠E-钙黏蛋白免疫组化结果（400×）

2.4 各组大鼠食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白平均光密度值比较

与正常组比较，模型组大鼠食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白平均光密度值升高，差异有统计学意义（P <0.05）；与模型组比较，西药组、胆胃方低剂量组及胆胃方中剂量组大鼠食管组织PAR-2 平均光密度值降低，西药组、胆胃方低剂量组大鼠食管组织E-钙黏蛋白平均光密度值降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与胆胃方低剂量组比较，胆胃方中、高剂量组大鼠食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白平均光密度值升高，差异有统计学意义（P <0.05）。见表2。

表2 各组大鼠食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白平均光密度值比较（）

表2 各组大鼠食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白平均光密度值比较（）

注：与正常组比较，aP <0.05；与模型组比较，bP <0.05；与胆胃方低剂量组比较，cP <0.05。PAR-2：蛋白酶激活受体-2

3 讨论

难治性GERD 目前仍是临床亟待解决的难题，宋冰等[10]运用24 h 食管多通道腔阻抗-pH 监测GERD患者，发现难治性GERD 患者反流以弱酸反流及碱反流为主，而GERD 以酸反流为主。难治性GERD 治疗常用中和胆酸、促胃肠动力、保护黏膜等，虽有效果但常不理想，而中医辨证治疗常有意外疗效。胆胃方由柴胡、郁金、香附、青皮、陈皮、黄连、吴茱萸、黄芩、海螵蛸、白芍、浙贝母、白及、枳壳、炒谷芽、炒麦芽、甘草等组成，具有疏肝和胃、清热化瘀的功效，临床主要用于碱性胃食管反流病（DGER、DER）、胆汁反流性胃炎[11-12]等证属肝胃不和的治疗。该方来源于江苏省名中医田耀洲教授，为南京中医药大学附属中西医结合医院院内制剂，使用10 余年，疗效确切。课题组前期用胆胃方治疗DGER 效果较好，本研究是对其可能的作用机制进行探讨。

PAR-2 是一种与G 蛋白相偶联的蛋白受体，可促进炎症因子释放[13]。严满等[14]研究显示PAR-2 会使食管下括约肌压力降低，增强食管下括约肌的松弛度，是GERD 发生的因素之一。多项研究结果显示PAR-2 通过多种途径参与GERD 的发病[15-16]。本研究显示，DER 大鼠食管组织中PAR-2 表达高于正常组；与模型组比较，西药组、胆胃方低剂量组及胆胃方中剂量组大鼠食管组织PAR-2 平均光密度值降低（P <0.05）。E-钙黏蛋白是细胞间连接的重要组成部分，与紧密连接蛋白相连共同维持细胞功能[17]。Jovov 等[18-19]研究发现，缺乏E-钙黏蛋白的白鼠模型中食管黏膜存在细胞间隙增宽，说明E-钙黏蛋白与食管黏膜的细胞间隙增宽有一定关系；同时，E-钙黏蛋白的裂解产物还可作为NERD 的生物标记。本研究显示，DER大鼠食管组织中E-钙黏蛋白表达高于正常组；与模型组比较，西药组、胆胃方低剂量组大鼠食管组织E-钙黏蛋白平均光密度值降低（P <0.05）。胆胃方能明显降低DER 大鼠食管黏膜PAR-2、E-钙黏蛋白的表达，这可能是胆胃方治疗DER 的机制之一。

诸多研究发现，E-钙黏蛋白表达的缺失与肿瘤的浸润和转移有关[20-23]。然而本研究结果与上述并不一致，模型组大鼠E-钙黏蛋白表达较正常组显著升高，给药干预后其表达降低。笔者查阅文献后发现E-钙黏蛋白与炎症的关系观察结果并不统一，如E-钙黏蛋白与子宫内膜异位症呈正相关[24]；胃苏颗粒治疗慢性胃炎能有效降低胃黏膜E-钙黏蛋白表达[25-26]。因此，阐释这一现象为课题组今后深入研究提供了思路。

另外，本研究显示，与胆胃方低剂量组比较，胆胃方中、高剂量组大鼠食管组织PAR-2、E-钙黏蛋白平均光密度值升高（P <0.05）。提示胆胃方低剂量组（成人每天用药等效量）效果最好，而胆胃方中剂量组、高剂量组效果一般，可能的原因是随着给药浓度增加，高浓度的药物灌入食管也是个刺激因素，反而会造成食管黏膜的损伤，加重炎症反应。

综上所述，胆胃方对DER 的治疗作用可能是通过降低食管组织PAR-2 及E-钙黏蛋白的表达从而改善食管黏膜炎症及病理来实现的。胆胃方影响PAR-2 及E-钙黏蛋白表达的具体机制有待于更深层次的研究。