薄荷醇促进SK-LU-1细胞凋亡的机制

陶兴魁，段 红，张兴桃，冯 凡*

(1.宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000；2.宿州市天然产物与功能性食品工程技术研究中心，安徽 宿州 234000)

薄荷醇，又称薄荷脑，是薄荷中的主要成分，一种环类单萜化合物，被广泛应用于食品、药品等领域[1]。近年来，关于薄荷醇对各种癌症细胞的抗癌作用的基础研究取得了一些进展。研究发现，薄荷醇对前列腺癌、结肠癌等多肿瘤细胞均有抑制作用[2-5]，其主要通过诱导肿瘤细胞的周期阻滞、凋亡及信号调控等方式抑制癌细胞增殖[6]。苗延青等[7]研究薄荷醇在适宜的浓度时，对胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用明显，抑制率为26.73%～42.53%。薄荷醇可激活DU145细胞中的TRPM8通道，诱导肿瘤细胞中Ca2+荧光强度，从而起到抑制细胞增殖的作用[8]。

目前，其他药物单体在抗肺癌细胞作用及相关机制等方面已有比较多的研究。罗林明等[9]研究发现，百合总皂苷对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭具有抑制作用，可通过下调PCNA的表达抑制肺癌细胞DNA合成，通过调控Bcl-2、Bax蛋白表达诱导肺癌细胞的凋亡。颜晓静等[10]研究丹参-人参组分配伍能够抑制肺癌A549细胞增殖，诱导凋亡和降低细胞骨架的面积，且抑制效果呈剂量依赖性。但目前关于薄荷醇在抗肺癌机制方面的研究报道较少，对于其通过自噬促进细胞凋亡机制方面的研究鲜见报道。因此，本实验以人肺癌SK-LU-1细胞为体外研究材料，将不同浓度的薄荷醇作用于肺癌SK-LU-1细胞，分析细胞增殖、凋亡及迁移特性，并检测自噬信号通路LC-3 Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、Atg12蛋白表达，以期为薄荷醇通过细胞自噬促进肺癌SK-LU-1细胞的凋亡机制提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞 人肺癌SK-LU-1细胞，购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 试剂与药物 薄荷醇(上海麦克林生化科技有限公司，批号C10458801，纯度≥99.5%)。细胞培养基DMEM(北京索莱宝科技有限公司，批号11965)；BI胎牛血清(美国Gibco公司，批号10270106)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号07302020)；5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)试剂盒(广州市锐博生物科技有限公司，批号R1127)；LC-3 Ⅰ/Ⅱ、Atg12、Beclin-1、GAPDH抗体(英国Biorbyt公司，批号orb33328、orb33381、orb380530、orb555879)；Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9抗体(美国CST公司，批号4223-T、5023-T、14220-T、9502-T)，保存于宿州学院生物与食品工程学院实验室；3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美国Sigma公司，批号M9281)；二抗抗体(美国Bioworld公司，批号BS13278)；Transwell小室(美国Corning公司，批号353090)。其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器 IX71倒置荧光显微镜、CX41型光学显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；Infinite 200 PRO型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；电子天平(万分之一，美国奥豪斯公司)；超微量分光光度计(美国Thermo公司)；电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；荧光成像系统(美国ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 37 ℃水浴加热解冻SK-LU-1细胞，接种于DMEM培养基(含12%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素)中，PBS洗涤后胰酶消化，置于5%CO2，37 ℃、饱和湿度培养箱中培养，3～4 d传代1次，共培养3～4代，取对数生长期的细胞进行实验。

2.2 CCK-8法检测薄荷醇对细胞增殖的影响 待细胞生长到对数生长期、密度达到80%以上后将其消化，制成细胞悬液，设置对照组(不加薄荷醇)和给药组(薄荷醇浓度25、50、100、200、400 μmol/L)，每组6个复孔，每孔100 μL细胞悬液(0.6×105/mL)接种于96孔板中[11]，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液(纯CCK-8∶纯培养基=1∶9)，放入CO2培养箱中孵育2 h左右，将处理好的培养板置于酶联免疫检测仪中，在450 nm波长处测定吸光度值(A)，生长抑制率=(1-A给药组/A对照组)×100%。

2.3 5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)检测方法检测薄荷醇对细胞增殖的影响 以每孔1.0×104个细胞接种于96孔板中，置于培养箱中培养24 h，吸弃细胞板旧培养液，给药组加入含薄荷醇50、100 μmol/L的完全培养液，另外设置对照组(不加薄荷醇)，平行6个复孔，加入250 μL溶液，培养箱培养48 h后参照EdU试剂盒步骤进行EdU标记细胞、固定促渗、检测及DNA复染等操作[12]，最后将培养板置于IX71倒置荧光显微镜下，随机选择拍摄荧光图像，采用Image J软件进行计数。

2.4 Transwell法检测薄荷醇对细胞迁移的影响 取对数生长期细胞，PET膜铺板，每小室加入200 μL细胞悬液，铺板时细胞数量为2.6×104个/孔放入每孔提前加好500 μL 20% DMEM的下室中，37 ℃放入二氧化碳培养箱中培养12 h，次日观察。进行薄荷醇培养操作，设置对照组(不加薄荷醇)和给药组(加入含薄荷醇50、100 μmol/L的完全培养液)，每组3个复孔，每个上室加入200 μL溶液，下室加入500 μL溶液，孵育48 h后室温固定30 min，染色30 min，棉签蘸水后吸干，在光学显微镜下随机拍摄图像，观察细胞形态[13]，采用Image J软件进行计数。

2.5 Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，将细胞密度1.0×105/mL的悬浮液接种于培养板上，每组4个复孔，随机分为对照组(不加薄荷醇)、薄荷醇组(100 μmol/L)，在培养箱中孵育48 h后取出，1 000 r/min离心，弃去上清液，根据Annexin V/PI试剂盒说明，用PBS洗细胞2～3次，不含EDTA的胰蛋白酶消化，再用4%PBS洗细胞2次，收集细胞进行重悬，加入5 μL AnnexinV/PI，室温避光染色10～15 min，加入2.5 μL PI试剂后，30 min内完成细胞凋亡的检测。

2.6 Western blot法检测自噬相关蛋白表达 取对数生长期细胞，接种在培养皿中培养，当细胞饱和度达到80%以上时分为对照组(不加薄荷醇)、薄荷醇组(100 μmol/L)、抑制剂组(自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤)、薄荷醇+抑制剂组(薄荷醇100 μmol/L+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤)，培养48 h，离心分离收集细胞，PBS漂洗2次，加入细胞裂解液进行裂解，收集细胞总蛋白。取蛋白样品25 μg上样，SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，室温封闭2 h，加入LC-3 Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、Atg12蛋白(1∶1 000)、GAPDH(1∶8 000)抗体，4 ℃孵育12 h，PBS漂洗3次，加入二抗(1∶10 000)，室温下孵育1.5 h，TBST洗膜2次，ECL显色，用凝胶成像系统拍照，采用Image J软件分析灰度，计算LC-3 Ⅰ/Ⅱ，Beclin-1、Atg12蛋白相对表达。

3 结果

3.1 薄荷醇对SK-LU-1细胞增殖的影响 图1显示，与对照组比较，不同浓度薄荷醇处理48 h后抑制率升高，并呈浓度依赖性，IC50为97.94 μmol/L，故选择50、100 μmol/L作为后续实验药物浓度。图2显示，50 μmol/L薄荷醇对细胞增殖的影响不明显，而在100 μmol/L下具有抑制作用(P<0.01)。

图1 薄荷醇对SK-LU-1细胞增殖的抑制率

注：A为染色成像图(EdU，×200)，B为阳性细胞百分率柱状图与对照组比较，**P<0.01。图2 薄荷醇对SK-LU-1细胞增殖的影响

3.2 薄荷醇对SK-LU-1细胞迁移能力的影响 图3显示，PET膜上迁移的细胞数目在薄荷醇浓度为50 μmol/L时减少不明显，而在100 μmol/L下可抑制细胞迁移侵袭，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，与“3.1”项下结果基本一致。

注：A为染色成像图(结晶紫染色，×200)，B为阳性细胞迁移数柱状图与对照组比较，**P<0.01。图3 薄荷醇对SK-LU-1细胞迁移的影响

3.3 薄荷醇对SK-LU-1细胞凋亡的影响 图4显示，对照组和给药组(50、100 μmol/L)细胞早期凋亡率分别为(0.53±0.12)%、(3.83±1.20)%、(21.83±1.87)%，中期凋亡率分别为(0.07%±0.03)%、(2.79±0.78)%、(4.79±1.40)%，晚期凋亡率分别为(0.20±0.05)%、(1.31±0.62)%、(1.30±0.57)%，表明100 μmol/L薄荷醇能促进细胞凋亡(P<0.01)。图5显示，100 μmol/L薄荷醇处理后Bcl-2表达降低，Bax、caspase-3、caspase-9表达升高。

图4 薄荷醇对SK-LU-1细胞凋亡的影响

注：A为蛋白免疫印迹图，B为蛋白条带灰度值扫描柱状图与对照组比较，*P<0.05。图5 薄荷醇对SK-LU-1细胞凋亡通路蛋白表达的影响

3.4 薄荷醇对SK-LU-1细胞自噬信号通路关键调控蛋白的影响 图6显示，与对照组比较，给药组SK-LU-1细胞自噬信号通路蛋白LC-3 Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1、Atg12表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)；虽然抑制剂组(自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤)抑制了自噬信号通路蛋白表达(P<0.05)，但薄荷醇+抑制剂组(100 μmol/L薄荷醇+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤)有所提高(P<0.01)。

注：A为蛋白免疫印迹图，B为蛋白条带灰度值扫描柱状图与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图6 薄荷醇对SK-LU-1细胞自噬通路蛋白表达的影响

4 讨论

薄荷醇在抑制多种肿瘤细胞的的增殖方面已有大量研究，其抑制肿瘤细胞增殖和迁移的可能机制也已有不少报道。研究薄荷醇对小鼠皮肤癌变的预防潜力中发现，薄荷醇能明显抑制皮肤癌细胞的增殖和生长，显著降低肿瘤发生率[5]。越来越多的证据表明，薄荷醇通过TRPM8非依赖性途径抵抗多种人类的癌症细胞增殖扩散。薄荷醇通过独立于TRPM8的Ca2+流入机制，促使Ca2+在PC-3细胞中增加，在高浓度薄荷醇作用下可诱导前列腺癌细胞凋亡[14]。研究薄荷醇对PC-3前列腺癌细胞基因表达的影响发现，薄荷醇诱导G2/M阻滞，特别是显著下调了G2/M期进展的关键调控因子PLK1，并抑制了其下游信号通路[15]。还有研究表明薄荷醇可以通过TRPM8通道诱导人膀胱癌细胞系T24细胞线粒体膜去极化，导致细胞死亡[16]。

本研究通过CCK-8法和EdU法研究薄荷醇对肺癌SK-LU-1细胞增殖的影响，结果表明薄荷醇对肺癌SK-LU-1细胞增殖有抑制作用。当薄荷醇浓度为100 μmol/L，肺癌SK-LU-1细胞在作用48 h后抑制作用显著(P<0.01)；分析Transwell迁移实验结果，薄荷醇对肺癌SK-LU-1细胞迁移作用在100 μmol/L时抑制效果明显(P<0.01)，综合该部分薄荷醇实验结果发现，当薄荷醇浓度为100 μmol/L时，肺癌SK-LU-1细胞增殖和迁移抑制作用显著。

本研究选用肺癌SK-LU-1细胞，流式细胞术检测薄荷醇对肺癌SK-LU-1细胞凋亡的影响，并且免疫印迹实验检测薄荷醇对细胞凋亡通路蛋白表达的影响。结果表明薄荷醇能够通过降低凋亡通路蛋白Bcl-2的表达以及提高Bax、caspase-3、caspase-9的表达促进肺癌细胞发生细胞凋亡，同时提高自噬信号通路关键蛋白LC-3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg12的表达。目前的研究显示Atg5和Atg12为自噬小体形成的“核心”，是启动自噬小泡形成的重要蛋白质，在癌细胞凋亡过程中起到关键调控作用。Atg5可以被Caplains剪切，导致Atg5 N端片段以一种特定未知的机制转移，在线粒体上与抗凋亡蛋白Bcl-xL结合，促使线粒体细胞大量释放C色素，从而诱导细胞凋亡[17]。研究发现在不同凋亡因子刺激下，Atg12不但是caspase激活所必需蛋白，它还可通过不同途径结合Bcl-2、Mcl-1表现促凋亡能力，进一步研究发现，Atg12是因为具备和Bcl-2、Mcl-1结合的BH3结构域而具有促使细胞凋亡功能[18]。而薄荷醇对肺癌SK-LU-1细胞具有明显的促凋亡作用，且能够提高Atg12蛋白表达，同时能够促进形成自噬小体关键囊泡蛋白LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表达，说明薄荷醇能够活化肺癌细胞的自噬信号通路，从而诱导肺癌细胞发生凋亡，抑制肺癌细胞的增殖和迁移。该结果为薄荷醇抗肺癌研究及其分子机制研究提供了新思路，为薄荷醇在治疗肺癌上提供了新的理论和实验基础。