QuEChERS/UPLC-MS/MS法测定中药材中代森锰锌和丙森锌残留

兰 岚，袁佳佳，周 恒，苗 水，李雯婷，季 申

(上海市食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量控制重点实验室，上海 201203)

二硫代氨基甲酸酯(盐)类农药(Dithiocarbamates，DTCs)是一系列具有广谱抗菌作用的杀菌剂，优良的抑菌性[1-2]和耐药性[3]使其在各种作物的种植中应用广泛，近年来该类农药的使用范围扩大至根茎类等中药材[4-6]，且使用量不断呈上升趋势。食品安全国家标准GB2763-2019规定了人参、三七块根和须根中DTCs的最大残留限量[7]，对中药材中DTCs残留量的测定提出了更高的要求。

由于DTCs化学性质特殊，难以直接测定[8]，目前国内外法规多通过GC法或GC-MS法测定酸解反应生成的二硫化碳(CS2)达到测定DTCs残留总量的目的[9-11]。CS2法主要有2个缺陷，首先该方法只能测定残留总量，难以区分DTCs的亚类；其次易产生假阳性结果。据报道，含有植物源CS2，如异硫氰酸苯酯和色胺硫代氨基甲酸酯的十字花科植物，或有腐败倾向的基质在酸解作用下生成CS2，从而导致假阳性[12-13]。中药材基质复杂，化学成分丰富，与该领域研究较多的食品基质相比较，中药材中DTCs的测定难度更大。为解决上述问题，亟需开发原理不同的检验方法，以期与CS2法互补，更好地为中药材中DTCs的残留研究服务。

本研究以代森锰锌为典型代表的乙撑二硫代氨基甲酸酯(盐)类杀菌剂(EBDs)和以丙森锌为典型代表的甲基乙撑二硫代氨基甲酸酯(盐)类杀菌剂(PBDs)为检测对象，选取典型根茎类中药材三七、人参、党参和黄芪，在特定pH的水溶液中将代森锰锌和丙森锌分别转化为水溶性的钠盐，继而采用碘甲烷为衍生化试剂将代森钠和丙森钠转化为对应的甲基化产物，经分散固相萃取净化后氮吹浓缩，供UPLC-MS/MS检测。研究采用甲基衍生化结合QuEChERS样品前处理，以碘甲烷-乙腈溶液作为甲基化产物的提取溶剂和衍生反应媒介，简化了操作程序，实现了中药材中代森锰锌和丙森锌的快速、专属测定，有利于掌握更多的农药施用和残留信息。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；API 5500三重四极杆串联质谱仪(美国AB SCIEX公司，配置AB SCIEX数据处理软件、ESI+电喷雾源)；Sartorius MSU225P-ICE-DU、Sartorius CP224S型电子分析天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；震荡仪(美国FLUK公司)；涡旋仪(德国IKA公司)；氮气吹干仪(美国OI-SYS公司)；Centrifuge 5810 R型离心机(德国Eppendorf公司)；Agilent Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3.0 mm，2.7 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，均购自美国Agilent公司。

1.2 试剂与药物 甲酸、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、盐酸(上海凌峰化学试剂有限公司)；氯化钠、无水硫酸镁、氢氧化钠、L-半胱氨酸盐酸盐(一水)和四丁基硫酸氢铵(国药集团化学试剂有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、硅胶、C18和石墨化碳黑(天津博纳艾杰尔科技有限公司)；碘甲烷[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，纯度>99.5%]；代森锰锌(批号80328，78.4%)、丙森锌(批号978990，85.0%)和同位素内标氘代莠去津(德国Dr.Ehrensterfer GmbH公司)。

1.3 材料 为保证方法的通用性，前处理条件优化中，考察了净化填料对三七、金银花等不同药用部位的净化效果。由于多年生根茎类中药材常定期施用代森锰锌、丙森锌以防治根部腐烂，实验主要对三七、人参、党参和黄芪进行了方法学考察。所有药材均为国家抽验性评价样品，均由上海市食品药品检验研究院中药/天然药物保健食品室杨新华老师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～2.00 min，60%～25% A；2.00～6.00 min，25% A；6.10～8.00 min，5% A；8.10～11.00 min，60% A)；体积流量0.30 mL/min；柱温35 ℃；进样量5.0 μL；内标法定量；代森锰锌甲基化产物定量离子m/z134，定性离子m/z117、193；丙森锌甲基化产物定量离子m/z206.9，定性离子m/z131.2；氘代莠去津定量离子m/z178.8，定性离子m/z101.1。三七代森锰锌、丙森锌加样样品的MRM图见图1。

1.代森锰锌 2.丙森锌1.mancozeb 2.propineb图1 三七中代森锰锌和丙森锌加样样品的MRM图Fig.1 MRM image for mancozeb and propineb in spiked Notoginseng Radix

2.2 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测模式；电喷雾电压5 500 V；雾化气压力50.0 psi(1 psi=6.895 kPa)；辅助气压力50.0 psi；气帘气压力20.0 psi；碰撞气压力7.0 psi；离子源温度450 ℃；扫描时间50 s；碰撞室入口电压10 V；碰撞室出口电压12 V。

2.3 化学衍生试剂制备

2.3.1 氢氧化钠溶液(10 mol/L)取氢氧化钠40 g，加水使溶解成100 ml，即得。

2.3.2 EDTA-Na2碱性提取液 取L-半胱氨酸盐酸盐2.5 g、EDTA-Na246.73 g和氢氧化钠9 g，加水500 mL使溶解，以10 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9～10，即得。本液应在凉处避光保存。

2.3.2.1 四丁基硫酸氢铵溶液 称取13.6 g四丁基硫酸氢铵，加水定容至100 mL。

2.3.2.2 碘甲烷-乙腈溶液 取碘甲烷1 mL，加乙腈300 mL，混合均匀，即得。

2.4 对照品溶液制备

2.4.1 对照品贮备液 准确称取适量代森锰锌、丙森锌标准物质，用乙腈配制成100 mg/L的对照品贮备溶液，用前振摇3 min使混悬均匀。本液应在-20 ℃避光保存。

2.4.2 内标溶液 准确称取适量氘代莠去津，用乙腈逐级稀释成6 mg/L的内标溶液。

2.5 样品前处理

2.5.1 提取 取中药材样品，粉碎成粉末(过3号筛)，取约3 g(准确至0.01 g)，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入碱性EDTA-Na2提取溶液10 mL，涡旋使样品充分浸润，置振荡器上剧烈震荡20 min，4 000 r/min 离心5 min，转移上清液于另一50 mL聚苯乙烯具塞离心管；残渣再用碱性EDTA-Na2提取溶液重复处理2次，每次5 mL，合并碱性提取液。以6 mol/L盐酸调pH值至8.0，加入四丁基硫酸氢铵溶液1 mL，混合均匀。精密加入0.1 mol/L碘甲烷-乙腈15 mL，再精密加入100 μL内标溶液，置振荡器上剧烈震荡20 min(500次/min)，放置10 min后，加入无水硫酸镁与氯化钠的混合粉末(2∶1)6 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡3 min(500次/min)，于冰浴中冷却3 min，4 000 r/min离心5 min。

2.5.2 净化与浓缩 精密移取上清液9 mL，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管(无水硫酸镁900 mg、PSA300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶300 mg、石墨化炭黑90 mg、硅胶300 mg)中，涡旋使充分混匀，再置振荡器上剧烈震荡5 min(500次/min)使净化完全，4 000 r/min离心5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹仪上吹至约0.4 mL，加乙腈定容至1 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜(孔径0.22 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.6 基质混合对照品使用液 分别移取一定体积的代森锰锌、丙森锌对照品贮备液稀释得到1、10 mg/L的混合对照品溶液，将适量混合标准溶液加入空白基质中，按 “2.5”项下方法制备，得到5、10、50、100、200、400、1 000 μg/L的基质混合标准使用液。以2种农药的对照品使用液的质量浓度为横坐标(X)，各物质的定量离子对峰面积为纵坐标(Y)，绘制基质匹配标准曲线。

2.7 方法学验证

2.7.1 线性关系考察 按优化的实验条件，代森锰锌、丙森锌分别在5～1 000 μg/L范围内线性良好(r>0.99)。以线性最低点作为定量限样品溶液，定量定性峰均可被检测到且信噪比均大于10，折算2种农药的定量限均为0.005 mg/kg。结果见表1。

表1 各样品线性关系Tab.1 Linear relationships of various samples

2.7.2 稳定性试验 取避光保存的1 000 μg/L的三七基质混合标准使用液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，结果显示样品溶液中丙森锌甲基化衍生产物的稳定性较差，最好于衍生反应后的12 h内完成进样。

2.7.3 加样回收率试验 以空白中药材样品中添加回收实验确定代森锰锌、丙森锌的加样回收率，4个加样水平分别为0.005、0.01、0.05、0.10 mg/kg，每个加样水平均平行测定7次，代森锰锌的加样回收率在78.3%-99.6%，丙森锌的加样回收率在75.2%～100.4%，精密度以加样回收率RSD表示，代森锰锌加样精密度为2.1%～9.5%，丙森锌加样精密度为2.3%～9.3%。方法的准确度和精密度均符合农药残留分析要求，方法重现性良好，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果(n=7)Tab.2 Results of recovery tests for various constituents(n=7)

2.7.4 基质效应 将适量混合标准溶液加入空白基质中，除不称取中药材样品外，其余按 “2.5”项下方法制备，得到代森锰锌、丙森锌的溶剂混合对照品溶液，与4种中药材的基质匹配混合对照品溶液一同进样检测，分别绘制标准曲线。结果显示净化效果较好，三七、人参、党参和黄芪的抑制率均控制在3.2%～9.7%。

由于不同中药材基质对衍生反应的影响程度不同，定量时采用了空白基质匹配标准曲线以减少基质效应和甲基化反应的影响。

3 讨论

3.1 甲基化试剂和反应溶剂考察 DTCs测定中常用的甲基化衍生试剂有硫酸二甲酯[14-16]和碘甲烷[17-19]。碘甲烷可与常见的有机溶剂混溶，化学性质稳定，毒性较硫酸二甲酯毒性小，且过量的碘甲烷可通过氮吹除去，不需要额外的淬灭操作，因此选用碘甲烷作为衍生化试剂。常用的反应溶剂为三氯甲烷-正己烷(3∶1)，抽滤、溶剂替换等操作步骤多，时间、人力成本高，有机试剂消耗大，难以保证检验效率并带来环境污染等问题。本研究与国际化标准接轨，采用QuEChERS前处理方法，使用碘甲烷-乙腈作为甲基化产物的提取溶剂和衍生反应的媒介，简化了操作程序。

3.2 净化填料配比考察 在三七、金银花空白样品中添加1 mg/kg的代森锰锌和丙森锌，按供试品溶液的制备方法提取、反应，保持单一变量的因素考察不同净化填料对三七、金银花的净化效果，结果表明适当的净化手段可以增强待测化合物的响应。无水硫酸镁的用量为900 mg，旨在进一步除去有机相中的水，保证其他净化填料的吸附效果。C18为通用的净化填料，对2个待测产物的响应影响不大，确定用量为300 mg。在此基础上考察了PSA用量为0、300、600 mg对三七、金银花的阳性样品的净化效果，结果表明三七、金银花基质中PSA用量对代森锰锌衍物的响应整体影响不大，但随着用量的增加，丙森锌衍生物的响应迅速降低，表明PSA用量不宜过大。鉴于石墨化碳PC在吸附色素方面的优势，净化调料中使用量为90 mg。三七在硅胶用量为300 mg时代森锰锌、丙森锌衍生物响应最高。基于以上考察结果，最终净化填料使用配比为无水硫酸镁900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、PC 90 mg、硅胶300 mg。

近年来农药残留研究热点主要围绕在仪器的高精尖、检测参数的高通量等方面，而常常忽视一些化学性质特殊的农药。作为根茎类、叶类药用植物使用频率最高的杀菌剂之一，自DTCs被发明和使用以来，其残留研究虽然起步较早，但较集中于食品领域，中药材中该类农药的检测仍缺乏深入研究，目前研究数据证实CS2法存在假阳性的可能，而甲基化衍生产物稳定性欠佳，且在某些中药材基质中存在干扰，凸显了特殊农药个性化研究的重要性。

4 结论

本研究采用碱性提取液，将代森锰锌、丙森锌转化为水溶性钠盐，在合适的衍生化条件下，采用碘甲烷-乙腈溶液，同时实现甲基化反应和QuEchERS前处理，进而建立了三七、人参、党参和黄芪中代森锰锌、丙森锌QuEChERS/UPLC-MS/MS的检测方法。该方法灵敏度高，可与CS2法互为补充，精准测定中药材中二硫代氨基甲酸酯(盐)类杀菌剂亚类的残留。