基于UPLC指纹图谱结合化学模式识别的肚痛丸质量控制

尚 晓，曾瑚瑚，陈 烨，王 英，黄晓君，范春林，叶文才

(暨南大学中药及天然药物研究所，广东省中药药效物质基础与创新药物研究重点实验室，广东 广州 510632)

肚痛丸由干姜、豆蔻(去壳)、肉桂、枳实(麸炒)、木香、乌药、厚朴(姜制)、砂仁、荜茇、罂粟壳10味药材组成，具有温中散寒，理气止痛的功效，临床上主要用于寒凝气滞所致的腹中冷痛、胸胁胀闷、呕逆吐酸等症，其质量标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(中药成方制剂第六册)，但仅有外观、性状、水分、重量差异等丸剂项下常规检查项目[1]，仅文献[2]采用GC法同时测定其中6种成分的含量。因此，本实验建立肚痛丸UPLC指纹图谱，并结合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)进行综合分析，以期为该制剂稳定性评价及质量标准提高提供依据[3-11]。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪[沃特世科技(上海)有限公司]；Agilent 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF高分辨四级杆-飞行时间质谱仪(美国安捷伦公司)，配置标准电喷雾离子源(ESI)、MassHunter Acuquisition色谱工作站、Qualitative Analysis数据处理软件；BX8200HP型超声仪(上海新苗医疗器械制造有限公司)；EX225DZH型电子天平[0.01 mg，奥豪斯仪器(常州)有限公司。色谱纯甲醇、乙腈(山东禹王和天下新材料有限公司)；质谱纯甲醇、乙腈(德国Merck公司)；质谱纯甲酸[阿拉丁试剂(上海)有限公司]；水为Milli-Q超纯水(美国Millipore公司)。

橙皮苷(批号wkq19013105)、香蜂草苷(批号wkq19010204)、胡椒碱(批号wkq18050704)、和厚朴酚(批号wkq19022708)、厚朴酚(批号wkq19022605)对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司；芸香柚皮苷(批号181009)对照品购于成都植标化纯生物技术有限公司，纯度均≥98%。40批肚痛丸来源于广州白云山中一药业有限公司，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

2.1.1 色谱 ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相水(含0.1%甲酸)(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0～3 min，5%～35%B；3～12 min，35%～53%B；12～13 min，53%～65%B；13～24 min，65%～80%B；24～27 min，80%～95%B；27～35 min，95%B)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；检测波长254 nm；进样量2 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，正、负离子模式，扫描范围m/z100～1 500；干燥器体积流量8.0 L/min，温度325 ℃；雾化器压力35 psi(1 psi=0.133 kPa)；锥孔电压75 V；毛细管电压4 000 V(+)、3 500 V(-)。数据处理工作站采用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.06.00。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取芸香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、胡椒碱、和厚朴酚、厚朴酚对照品各约10 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得贮备液(1 mg/mL)，取1 mL置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL含100 μg该成分)。

2.2.2 供试品溶液 取丸剂适量，研细，取粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声(100 Hz)处理60 min，冷却至常温，甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液适量，置于2 mL离心管中，离心(13 000 r/min)20 min，即得。

2.3 参照峰确定 由于6号峰(厚朴酚)与其他色谱峰分离度良好，保留时间、峰面积适中，故选择其作为参照峰(S)。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取丸剂(批号X1708)粉末约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，每次2 μL，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取丸剂(批号X1708)粉末约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，每次2 μL，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取丸剂(批号X1708)粉末约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，每次2 μL，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于3.0%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 UPLC指纹图谱建立

2.5.1 共有峰标定 取40批丸剂粉末，每批1.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，指纹图谱见图1。将其以CDF格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评级系统”(2012版)，采用中位数法，设定时间窗为0.1，6号峰(厚朴酚)为参照峰，经多点校正自动匹配后生成对照UPLC指纹图谱，选择图谱中峰面积较大、分离度较好的色谱峰作为共有峰，结果共标定出10个。

图1 40批样品UPLC指纹图谱

2.5.2 共有峰指认 在“2.1”项条件下通过UPLC-Q-TOF-MS技术对色谱峰进行鉴定，通过紫外吸收光谱、精确分子量信息、相关文献数据初步鉴定了10个共有峰，其中1～6号峰经对照品确认，结果见图2～3、表2。

表2 共有峰鉴定结果

图2 样品正、负离子TIC图及UPLC图

2.5.3 相似度评价 以图3为参照，计算各批样品相似度，结果见表3，可知均大于0.990，表明不同样品之间的一致性较好。以6号峰(厚朴酚)为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD均小于1.0%，但相对峰面积RSD在13%～34%之间，其中1、3、7号峰相差最大(RSD均大于21%)，见表4，表明各成分含量在不同批次样品中存在一定差异。

表3 40批样品相似度测定结果

表4 40批样品共有峰相对峰面积测定结果

1．芸香柚皮苷 2．橙皮苷 3．香蜂草苷 4．胡椒碱 5．和厚朴酚 6．厚朴酚 7．pipernonaline 8．guineensine 9．(2E,4E,12Z)-N-isobutylocatadeca-2,4,12-trienamide 10.(2E,4E,14Z)-N-isobutyleicosa-2,4,14-trienamide图3 样品对照UPLC色谱图

2.6 化学模式识别

2.6.1 主成分分析(PCA)将40批样品10个共有峰的峰面积进行标准化处理，得到10阶×40阶数据矩阵，导入SIMCA 13.0软件中，得到方差贡献率。结果，第一、第二、第三主成分贡献率分别为46.8%、31.9%、9.8%，累积贡献率达88.5%，可反映指纹图谱共有峰的基本信息，再对其峰面积适当权重后进行PCA分析，结果见图4。由此可知，各样品可聚为2类，S1～S16、S26～S40为Ⅰ类，S17～S25为Ⅱ类，并且Ⅱ类中1、3号峰相对峰面积明显小于Ⅰ类，4、7号峰相对峰面积明显大于Ⅰ类，可能是样品聚为2类的主要原因。

图4 40批样品PCA得分图

2.6.2 差异性成分筛选 根据“2.6.1”项下结果，将40批样品分成A、B两组，进一步通过OPLS-DA进行分析，结果见图5。由此可知。R2Xcum(反映X矩阵解释率)=0.863，R2Ycum(反映模型稳定性)=0.973，Q2(反映模型预测性)=0.968，均大于0.5并接近1，表明模型稳定可靠。

图5 40批样品OPLS-DA得分图

再根据变量权重的重要性排序(VIP)值对共有峰进行筛选，结果见图6，VIP值越大，对分组区分的贡献率越大，差异越明显[16-17]。本实验以VIP值>1.2为标准，筛选出物芸香柚皮苷(1号峰，来源于枳实)、香蜂草苷(3号峰，来源于枳实)、pipernonaline(7号峰，来源于荜茇)为主要差异性成分，与表4一致。

图6 10个共有峰VIP值

3 讨论

本实验对不同提取方法(冷浸、超声、加热回流)、提取溶剂(30%甲醇、70%甲醇、甲醇、95%乙醇)、提取时间(30、60、90 min)、料液比(1∶30、1∶50、1∶70)、流动相(甲醇-水，甲醇-酸水，乙腈-水，乙腈-酸水)、检测波长(210、254、280、330 nm)、色谱柱[ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Agilent Eclipse Plus C18RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)]、柱温(30、35、40、45 ℃)、体积流量(0.25、0.30、0.35、0.40 mL/min)进行考察，最终确定为“2.1.1”项下色谱条件。

结果显示，40批肚痛丸(S1～S40)的相似度均大于0.99，表明其质量在整体水平上具有较好的一致性；UPLC指纹图谱中以6号峰为参照峰，共标定10个共有峰；各批样品分为2类，S17～S25聚为Ⅱ类，其余聚为Ⅰ类；3种差异性成分来自枳实(芸香柚皮苷、香蜂草苷)、荜茇(pipernonaline)，与峰面积分析结果一致，这也是造成样品分为2类的主要原因，而且2类样品中三者含量有差异，其原因可能为①Ⅱ类样品在生产投料时，枳实中芸香柚皮苷(峰1)、香蜂草苷(峰3)含量较低，而荜茇中pipernonaline(峰7)含量较高；②样品经过长期贮存后，荜茇中pipernonaline发生降解，故Ⅰ类样品(较Ⅱ类样品生产早1～2年)中其含量有所下降，同时芸香柚皮苷、香蜂草苷、pipernonaline峰面积较小，也是40批样品潜在的差异性成分，但三者在指纹图谱中的贡献较小。

综上所述，UPLC指纹图谱结合化学模式识别可快速、准确地评价不同批次肚痛丸的质量差异和重点成分，从而为全面控制和整体评价该制剂质量提供科学依据。