貉源绿脓杆菌分离鉴定

王建军，莫玲，郭广君，韩强，姚春阳，王玉茂

摘要：为确诊引起山东省潍坊市某貉子养殖场的主要细菌性疾病，对该养殖户送检的病死貉子进行剖检，根据病貉的临床症状、病理剖检变化及其对分离纯化的细菌进行形态特征观察、生化试验、细菌16S rDNA PCR鉴定、药物敏感试验，初步确诊为绿脓杆菌感染。药物敏感试验结果表明，分离菌株对恩诺沙星、硫酸粘杆菌素、氟苯尼考中敏，对头孢噻呋、庆大霉素、替米考星、多西环素、林可霉素、阿莫西林耐药。

关键词：貉;绿脓杆菌;药敏试验;PCR鉴定

Isolation and PCR Identification of Pseudomonas Aeruginosa from Raccoon

Wang Jianjun1， Mo Ling1， Guo Guangjun1， Han Qiang2， Yao Chunyang1， Wang Yumao1

（1.Shandong Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy; 2. Shandong LVDU Bio-science & Technology Co.， Ltd， Binzhou， Shandong， 256600）

Abstract： In order to diagnose the main bacterial diseases caused by a raccoon dog farm in Weifang City， Shandong Province， the dead raccoon dogs sent by the farmer for examination were dissected. According to the clinical symptoms and pathological changes of the sick raccoon dogs and the morphological characteristics observation， biochemical test， bacterial 16S rDNA PCR identification and drug sensitivity test of the isolated and purified bacteria， it was preliminarily diagnosed as Pseudomonas aeruginosa infection. The results of drug sensitivity test showed that the isolated strains were moderately sensitive to enrofloxacin， Colistin sulfate and florfenicol， but resistant to ceftiofur， gentamicin， timicosin， doxycycline， lincomycin and amoxicillin.

Keywords： Raccoon; Pseudomonas aeruginosa; drug sensitivity test; PCR identification

綠脓杆菌（pseudomonas aeruginosa），又称铜绿假单胞菌，1882年首先由Gerssard从伤口脓液分离得到[1]，该菌广泛存在于自然界中，是一种临床上较为常见的人畜共患条件性致病[2]，主要经呼吸道、消化道和接触等多种途径易引起多种动物及人原发或继发或混合感染[3]，对多种畜禽均有不同程度的危害[4]，可导致水貂、狐、貉等毛皮动物出血性肺炎或经产道感染导致狐狸、貉子的内膜炎，经创伤感染引起化脓。该病常发生于温暖、潮湿的季节，在我国毛皮动物养殖区域广泛流行，其特点是发病急、病程短、死亡快，多呈地方性暴发性流行[5]，给毛皮动物养殖业造成了较大的经济损失[6]。

山东省潍坊市某貉子养殖合作社现有养殖量为1，500只，在3月龄出现咳嗽、流鼻涕、个别貉口、鼻有血液流出的疾病，发展迅速，严重时1d出现100余只发病，每天出现死亡，严重时日死亡60余只。死亡率在10%～30%左右。给养殖户造成了严重的经济损失。

对来诊病死貉子进行病理剖检，病理变化为肺脏充血、出血，严重的有出血斑，肺脏有明显的结节状突起，切面流出血样性泡沫液体。心肌呈松软状态，冠状沟存在出血点，脾脏肿大、色暗，肺门淋巴结有出血、水肿变化。肾脏出血、严重的有出血斑。采集剖检病貉的肺、肝、肾进行病原分离和PCR鉴定，现将结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1）试剂 药敏纸片，药敏纸片购自北京天坛生物制品股份有限公司;DNA Marker、Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司;基因组DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。

2）PCR引物设计 16SrRNA扩增引物序列来自参考文献[7]，引物序列为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。引物委托上海生工生物技术有限公司合成。

3）培养基 血清琼脂培养基、营养琼脂培养基、5%小牛血清的马丁液体培养基均由本实验室自制。

1.2 方法

1）细菌分离培养、药敏试验 将病死貉子肺脏、肝脏、肾脏病料接种于血清琼脂培养基中，37℃培养24h。挑取典型菌落用生理盐水稀释后，涂布于营养琼脂培养基，平铺药敏纸片继续培养24h，进行抑菌环直径测定，根据参考文献判定标准进行判定[8]。并将细菌进行革兰氏染色和镜检。

2）生化试验 将纯化菌接种不同生化管，37℃培养24～48h后，观察生化反应特性及氧化酶试验。

3）PCR鉴定 将纯化的单个菌落，接种于含5%小牛血清的马丁液体培养基中，37℃ 200r/min，振荡培养18h后，利用基因组DNA、抽提试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）提取分离菌株的基因组DNA作为PCR的模板，进行PCR扩增。反应体系（50μL）：10×Buffer（含MgCl2）5μL，上、下游引物各2μL（20pmol/L），dNTP 4μL，TagDNA聚合酶0.5μL，模板1μL，加水补足至50μL。扩增反应程序：94℃ 5min;94℃ 20s，58℃ 30s，72℃ 40s，30个循环，72℃ 10min。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，并送上海生工生物工程股份有限公司進行测序鉴定。将测序结果与GenBank登录的绿脓杆菌基因序列同源性进行比较。

绿脓杆菌毒力基因的扩增反应体系（10μL）：2×PCR Mix 5μL，上、下游引物各0.5μL（20pmol/L），模板1μL，加水补足至10μL。反应程序为94℃ 3min;94℃ 30s，50℃ 2min，72℃ 2min，35个循环，72℃10min。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

经分离培养后，在营养琼脂平板上均形成光滑、边缘平坦、有芳香气味、有蓝绿色光泽菌落。菌体革兰氏染色阴性，细菌杆状单个或成对排列，无荚膜与芽胞形成。与已报道的文献中对绿脓杆菌形态特征的描述基本一致[9]。

2.2 理化特性鉴定

用纯化菌进行生化反应特性测定，本菌能分解葡萄糖、L-精氨酸，不分解乳糖、鼠李糖麦芽糖、菊糖、蔗糖、海澡糖、卫矛醇。能液化明胶，不水解淀粉。能利用柠檬酸盐、乙基酰胺。精氨酸脱氢酶试验和氧化酶试验阳性。

2.3 药敏试验

用该菌对9种动物常用药物的进行了敏感试验（表1），细菌分离物对恩诺沙星、硫酸粘杆菌素、氟笨尼考中敏，对头孢噻呋、庆大霉素、替米考星、多西环素、林可霉素、阿莫西林耐药。

2.4 分离菌株的PCR鉴定

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小约为1，436bp，与预期结果一致。结果见图1。16Sr DNA基因扩增产物经测序后利用Blast进行比对，将其与Gen Bank中不同来源的绿脓杆菌参考菌株16Sr DNA序列进行同源性及系统发育分析，同源性分析结果显示该分离菌间的核苷酸序列同源性为99%～100%，表明该分离菌属于绿脓杆菌。

3 讨论与结论

通过对本次病貉的化验室诊断，确诊本次疫病系绿脓杆菌感染所致。绿脓杆菌是引起毛皮动物肺炎的主要病原菌之一，其感染率和死亡率均较高，严重影响我国毛皮动物养殖业的健康发展[10]。随着集约化毛皮动物养殖业不断发展，绿脓杆菌引起的出血性肺炎对养殖业的危害日益严重。

绿脓杆菌在毛皮动物的发病主要在6～9月份高温高湿天气季节，这次分离菌株对9种常用药物药敏结果表明，分离菌株对恩诺沙星、硫酸粘杆菌素、氟苯尼考中敏，对头孢噻呋、庆大霉素、替米考星、多西环素、林可霉素、阿莫西林耐药。本厂按照药敏试验选择药物，5d控制了本病。这次9种药物未发现敏感药物，可能是貉子用过相关药物，造成了耐药菌株的产生。因此防控本病时，尤其在高发季节，应从加强养殖场生物安全措施着手，注重环境卫生及消毒措施的应用，保障饲料的新鲜并做好疫苗的防控。

当疫情发生时，迅速做出疫情诊断和药敏试验，避免盲目投药，造成经济损失。同时，可以参考已有研究的报道，采用中草药进行预防治疗。周琦等[3]研究表明，金银花、黄柏、板蓝根、诃子、五味子对貉源绿脓杆菌地方流行株体外抑菌效果较好。张玉等[11]研究发现，中药石榴皮、乌梅、地榆、五倍子、赤芍、白矾、生地榆、木瓜对临床分离的致病性水貂源绿脓杆菌吉林株抑菌效果比较好。因此，绿脓杆菌病的预防需要从管理、消毒和药物等几个方面进行，加强饲养管理、消毒杀菌、防治结合以加强本病的防控。

参考文献：

[1] Lusis PI. Pseudomonas aeruginosa[J]. Veterinary bulletin， 1971， 41（3）：53.

[2] 林芝.一例猫脂肪肝的诊治[J].黑龙江畜牧兽医，2015（5）：71-72.

[3] 周琦，肖丽荣，张召兴，等.20味中药对貉源绿脓杆菌地（下转第120页）（上接第117页）方流行株的体外抑菌活性研究[J].黑龙江畜牧兽医，2019（2）：145-147.

[4] 付莹，李文化，黄微.25例绿脓杆菌感染原因分析[J].华北煤炭学院学报，2011，13（11）：802.

[5] 白雪，柴秀丽，闫喜军，等.水貂绿脓杆菌分离株的生物学特性和血清型分析[J].畜牧与兽医，2011，43（7）：31-35.

[6] 李国华，史秋梅.水貂出血性肺炎的诊治[J].中国兽医杂志，2010，46（7）：82-83.

[7] Moreno C， Romero J， Espejo R T. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio[J]. Microbiology， 2002， 148（4）：1233-1239.

[8] 倪语星，王金良，徐英春.抗微生物药物敏感性实验规范[M].北京：上海科学技术出版社，2002.

[9] 牛钟相，李雅林.动物绿脓杆菌病研究进展[J].动物医学进展，2003，24（1）：16-18.

[10] 李巧玲，庞洪泽，张文举，等.狐源绿脓杆菌的分离鉴定及药敏试验[J].畜牧与兽医，2018，50（1）：99-102.

[11] 张玉，王雨，胡春燕，等.218 味单味中药抗水貂源绿脓杆菌的体外筛选[J].黑龙江畜牧兽医，2017（1）：184-186.