淋巴细胞活化基因3蛋白在自身免疫病中的研究进展*

汪达青，王卓，何春燕

(苏州大学附属第二医院检验科，江苏苏州215004)

淋巴细胞活化基因3蛋白(lymphocyte activation gene-3，LAG3, CD223)是由Triebel等于1990年在活化的T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)细胞上发现的跨膜糖蛋白，其分子结构与白细胞分化抗原4(cluster of differentiation 4,CD4)相似，具有免疫球蛋白超家族(immunoglobin superfamily， IgSF)样结构域[1]。LAG3可作为一种新型免疫检查点，与相应配体结合，负向调节免疫反应，在免疫自稳、免疫细胞增殖、活化、细胞因子产生的过程中发挥重要作用[2]。研究表明，慢性感染和肿瘤微环境中，LAG3介导T细胞功能障碍和免疫逃逸，加速疾病恶化[3-4]；而在自身免疫病中，lag3基因缺陷导致的自身免疫耐受性的丧失，与多种疾病的发生发展相关[5]。本文就LAG3及其在自身免疫病中的研究进展进行汇总阐述，以期为自身免疫病的发病、诊断及治疗提供新的认知和思路。

1 LAG3结构特点

lag3基因位于人类12号染色体(12p13.32)和小鼠6号染色体，与cd4基因相邻，编码含有498个氨基酸的蛋白质[6]，其结构可分为胞外区、胞内区和跨膜区。LAG3胞外区与CD4相似，由4个IgSF结构域(D1—D4)组成，为保证分子结构稳定，每个结构域内有1个二硫键，其中D1区是LAG3与配体结合的主要位点[1,7]。胞内区负责信号转导，由3个保守序列组成，分别是丝氨酸磷酸化位点、KIEELE基序和EP基序。研究表明，除KIEELE基序为LAG3分子行使功能所必需外，其他区域的突变对其功能没有影响[8]。此外，D4结构域和跨膜区之间还存在“连接肽”区域，此区域含有较长的氨基酸序列，易被金属蛋白酶水解，形成可溶性LAG3(soluble LAG3, sLAG3)[7]，sLAG3是否具有功能尚无统一定论。

2 LAG3表达

与其他抑制性受体相似，LAG3在NK和T细胞上诱导性表达。实验证实，初始T细胞的LAG3储存在溶酶体内，经PKC信号介导转移到表面，以防止细胞过度活化产生损伤[9]。近年来研究发现，部分免疫细胞不需要抗原的刺激，静息状态下即可表达LAG3，如浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)、调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)和1型调节性T细胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)。其中，pDC是目前发现的LAG3表达水平最高的免疫细胞，可通过LAG3间接调节T细胞稳态[10]，Treg和Tr1的免疫抑制功能也依赖LAG3分子[11-12]。此外，神经系统中也发现LAG3的存在，神经元表面的LAG3可促进病理α-突触核蛋白原纤维(α-synuclein preformed fibrils，α-syn PFF)内吞，加速帕金森综合征疾病进展[13]。总之，LAG3表达十分广泛，更多LAG3+细胞的发现及功能有待研究。

3 LAG3的信号转导及功能

研究表明，LAG3可与多种配体结合双向传递信号，包括MHC-Ⅱ分子、C型凝集素受体LSECtin、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、纤维蛋白原相关蛋白-1(fibrinogen-like protein 1，FGL-1)和α-syn PFF。

MHC-Ⅱ是LAG3经典配体。与CD4相比，LAG3与MHC-Ⅱ的结合亲和力约高100倍，但T细胞内，LAG3并不破坏CD4与MHC-Ⅱ的结合，而是通过下调胞内STAT5磷酸化的水平以及与LAG3相关蛋白(LAG-3 associated protein, LAP)相互作用，减少白细胞分化抗原3(cluster of differentiation 3，CD3)、T细胞受体(T cell receptor，TCR)表达，限制TCR-MHC信号驱动的细胞增殖，维持细胞稳态[14-17]。LAG3与MHC-Ⅱ的结合在配体细胞中也传递负向信号，调节 FcγRγ和ERK招募Src同源区2(Src-homology domain 2,SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶1(SH2-containing protein tyrosine phosphatase,SHP-1)，抑制细胞成熟[18]。LAG3还可与LSECtin、Gal-3、FGL-1结合，介导肿瘤免疫逃逸，此类配体在肿瘤细胞中表达增强，使CD8+T细胞分泌γ-干扰素(interferon γ, IFN-γ)、IL-2减少，细胞免疫作用减弱[19-21]。在神经系统中，LAG3介导LAG3独特配体α-syn PFF内吞和细胞传递，是引起神经元变性的重要驱动因素[13]。LAG3及其受体的研究，为临床相关疾病的治疗提供新的思路。

4 LAG3与自身免疫病

4.1LAG3与SLE SLE是一种慢性炎症性自身免疫病，好发于育龄女性，可累及多个器官，主要表现为皮疹、阳光敏感和关节疼痛。研究表明，提高LAG3水平能够有效减轻SLE自身免疫反应，IL-21单抗药物BOS161721即可逆转患者lag3基因的低表达，表现良好的治疗效果[22]。在易患狼疮的MRL/lpr小鼠中，LAG+Treg的移植也减少了自身抗体的产生，缓解疾病进展[23]，揭示LAG3+细胞在SLE中独特的调节作用。

4.2LAG3与多发性硬化症(multiple sclerosis，MS) MS是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，可分为多种表型，包括原发性进行性MS、继发性MS、复发缓解型MS、临床孤立综合征和放射学孤立综合征，其中以复发缓解型MS最为常见[24]。研究发现，关于lag3基因多态性与MS易感性的关系，不同地区的流行病学调查结果并不统一[25-28]。而LAG3分子对MS作用是肯定的。MS患者外周血单个核细胞中LAG3表达水平降低，且低残疾指数的患者与非低残疾指数的患者相比，LAG-3水平显著升高[29]，这表明LAG3是MS中的重要保护因素，且与疾病进展相关。LAG3还可在MS患者中枢神经系统调节炎症反应，肠道上皮内淋巴细胞和外周血CC族趋化因子受体9(C-C chemokine receptor type 9,CCR9)阳性的记忆性T细胞在发病期间均可迁移到中枢神经系统，通过LAG3抑制自身免疫，调节免疫反应[30-31]。而在对MS治疗措施的研究中发现，实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠中枢神经系统中LAG3+T细胞通过诱导Treg、Tr1细胞的产生，减少炎症因子的分泌，从而缓解小鼠临床症状[32-34]。

4.3LAG3与1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM) T1DM是器官特异性自身免疫病，由自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞，导致的胰岛素分泌绝对不足引起，好发于青少年。NOD小鼠是研究T1DM的常用模型。实验表明，整体lag3基因缺陷能够使NOD小鼠发病提前，胰岛T细胞浸润增加[35-36]。但LAG3在不同细胞中发挥的作用并不相同，据报道，CD4+T细胞、CD8+T细胞以及Tr1上LAG3表达增加与自发性糖尿病发病延迟有关，而Treg上LAG3的表达却限制了其增殖，加速自身免疫的进展[37-39]。此外，NOD小鼠血清中sLAG水平与疾病进展正相关，或可作为疾病监测重要指标[40]。然而目前为止，LAG3与T1DM的研究仅限于动物实验，还需更多临床实验数据加以支持。

4.4LAG3与类风湿关节炎 作为常见的慢性全身性自身免疫病，类风湿关节炎主要表现为对称性关节炎性病变，并随疾病进展，累及心、眼、肺、肾等多个器官。其中，LAG3+Treg在该病中扮演重要的角色，不仅可指示疾病预后，还发挥重要负向调节作用。有学者指出，类风湿关节炎患者疾病活动指数越高，LAG3+Treg比例越低；在疾病发生展过程中，LAG3+FOXP3-Treg和Tr1均可通过分泌IL-10，减少自身抗体的产生，抑制关节炎症[41-43]。这些研究表明，通过药物诱导类风湿关节炎患者体内LAG3+Treg的产生或许是疾病治疗行之有效的方法。

4.5LAG3与银屑病 银屑病，又称牛皮癣，是一种慢性复发性皮肤炎症疾病，典型表现为红色斑块伴有鳞屑，其发病与结缔组织内异常T淋巴细胞浸润有关。LAG3在银屑病中发挥的作用并不清楚，但针对LAG3药物显示出良好效果。Poirier等发现向猿猴静脉注射LAG3嵌合抗体A9H11能够防止T细胞驱动的皮肤炎症[44]，提出LAG3单抗治疗银屑病的可能性。随后，靶向自身反应性T细胞表面LAG3的抗体—GSK2831781正式进入临床试验[45]，结果表明，该抗体能够有效改善银屑病患者临床症状，揭示LAG3在自身免疫病治疗中的巨大潜力。

4.6LAG3与其他自身免疫病 在炎症性肠病研究中，发现肠道内Treg可通过LAG3分子与CX3CR1+巨噬细胞表面MHC-Ⅱ结合，减少IL-23和IL-1β的产生，预防结肠炎[46]。而在Hg诱导的自身免疫病模型中，lag3基因的缺陷使小鼠丧失自身免疫耐受，对疾病的易感性增加[47]。这些都表明LAG3作为抑制性受体对自身免疫病调节有重要意义，仍需进一步研究。

5 LAG3在自身免疫病中检测与应用

5.1lag3基因多态性的检测lag3基因多态性不仅与自身免疫病的易感性相关，也影响着疾病临床特征[26]。常见的基因多态性检测方法包括序列特异性引物PCR技术(PCR amplification with sequence specific primers, SSP-PCR)、扩增阻滞突变系统PCR(amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR)、限制性片段长度多态性PCR(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)和Mass-Array，其中，以Mass-Array法应用最为普遍。该法是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术，将PCR扩增后的核酸产物电离成单电荷离子，使其在电场的作用下加速通过飞行管道，从而根据飞行时间分析基因型信息。与其他检测方法相比，Mass-Array不能检测未知突变，但灵敏度高、检测速度快、高通量、结果可靠等优点使其应用更加广泛。

5.2LAG3表达的检测 与正常人相比，自身免疫病患者LAG3表达水平降低，且与疾病进展相关，检测外周血中免疫细胞LAG3表达情况有助于指示疾病预后，评价药物疗效，其常见方法有实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和流式细胞术。RT-qPCR在RNA水平通过实时监测荧光信号的变化分析基因的表达情况，而流式细胞术则通过检测细胞表面荧光标记单克隆抗体结合情况，在蛋白质水平上计算目的细胞数目及比例。2种方法均具有良好的特异性和准确性，但与RT-qPCR相比，流式细胞术不需要提取RNA，细胞样本可直接进行检测，更加简便、快速。

5.3血清LAG3的检测 血清中LAG3水平升高可作为自身免疫病的辅助诊断策略。ELISA是检测血清LAG3常用方法，其基本原理是依赖抗原抗体反应的特异性和酶促反应的专一性，使得底物显色程度与待测分子含量呈正相关。ELISA可分为直接法和间接法，其中直接法耗时少，更为快速，但信号放大程度有限；间接法灵敏度增加，且同种酶标二抗可标记不同的一抗，更加经济、实用。

6 小结和展望

随着自身免疫病的研究深入，发现LAG3是建立和维持自身免疫耐受性过程中不可或缺的分子，在固有免疫和适应性免疫应答中发挥重要调节作用，可作为自身免疫病治疗和诊断的潜在靶点。然而，在免疫细胞中，LAG3下游的信号通路并不完全清楚，不同细胞表达LAG3的功能也不尽相同，激活还是抑制LAG3受体，以及如何准确靶向LAG3表达的目的细胞是值得思考的问题。