C群脑膜炎奈瑟菌致流行性脑脊髓膜炎的病原学分析

赵树龙，刘乐，姜飞，邓丽华，马萍，康海全

(徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州221002)

流行性脑脊髓膜炎(epidemic cerebrospinalmeningitis, ECM)简称流脑，是由脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis, Nm)引起的急性呼吸道传染性疾病，具有起病急、病情发展快和病死率高等特点，常在冬春季节发病和流行，尤其以儿童多见[1]。脑膜炎奈瑟菌根据其荚膜多糖的特点，分为12个血清群(A、B、C、E、H、I、K、L、X、Y、Z和W135)，A、B、C、W135、Y以及Z群是目前主要流行的致病菌群[2]。我国流行性脑脊髓膜炎以A群和C群为主要流行群[2]，B群可引起散发病例。2021年3月江苏省徐州市发现1例青少年流行性脑脊髓膜炎病例，经研究分析为C群脑膜炎奈瑟菌引起，现将其病原学和分子分型特征结果报告如下。

1 材料与方法

1.1病历资料 患者男，12岁，2021年3月24日因为发热伴呕吐1 d，意识模糊8 h，紧急收入徐州医科大学附属医院。入院时体温37.5 ℃，昏迷状态，精神反应差，全身皮肤未见皮疹出血点，浅表淋巴结未及肿大，扁桃体无肿大、充血，未见脓点及疱疹，呼吸平稳，双肺听诊呼吸音粗，未及明显干湿啰音，心率约85次/分，心律齐，心音有力，未及明显杂音，腹软，肝脾不大，四肢活动自如，肌张力正常，Babinski征：阳性。入院时，血常规检测：白细胞总数38.7×109/L，中性粒细胞比例95.3%，C反应蛋白9.58 mg/L；脑脊液常规检测：外观成乳白色浑浊，蛋白质3.48 g/L，白细胞计数26.3×109/L，葡萄糖2.25 mmol/L，氯化物111.7 mmol/L。入院后病危，予心电监护、鼻导管吸氧、床旁隔离，予万古霉素联合头孢曲松抗感染，丙种球蛋白减轻免疫反应，地塞米松减轻炎症反应，甘露醇联合甘油果糖氯化钠注射液交替降颅压，复合辅酶保护脏器及营养支持对症治疗。同时进行腰穿检查。入院当天采集患者脑脊液标本注入血平板培养，5% CO2、36.5 ℃培养，同时采集双侧双瓶血进行血培养。第2天脑脊液培养阴性，血培养提示阳性。将患者血培养阳性培养液转种血平板，5% CO2、36.5 ℃培养。第3天脑脊液培养血平板与血培养转种血平板均长出菌株。革兰染色见革兰阴性双球菌，为脑膜炎奈瑟菌疑似菌株。后转至传染病医院进一步治疗，病例追踪了解到病人根据相关的药敏结果提示，选择使用青霉素治疗后病情明显好转并已出院。

1.2试剂与仪器 普通血平板、M-H平板、质控菌株ATCC 25922、肺炎链球菌ATCC 49619(南京便珍生物科技有限公司)；药敏纸片：青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南、阿奇霉素、氯霉素、利福平、米诺环素、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、萘啶酸(英国Oxiod公司)；微生物质谱鉴定仪(德国Bruker公司)，2720型PCR扩增仪(美国ABI公司)，CYCP-31CN微型琼脂糖电泳仪(北京六一仪器厂)，成像分析仪、Powerpac高流电泳仪(美国Bio-Rad公司)，HC-2518高速离心机(安徽中科中佳公司)，DTC-100恒温金属浴(杭州瑞诚仪器有限公司)，Golden Easy PCR System(天根生物公司)，ABI 3730XL测序仪(ABI公司)。引物合成和测序均由上海生工生物工程公司完成。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定 将血培养阳性菌株转种血平板，置5% CO2培养箱36.5 ℃培养20 h。对血平板分离菌株进行质谱仪鉴定。

1.3.2PCR分型 从血平板上挑取多个菌落混悬于200 μL灭菌蒸馏水中，100 ℃煮沸10 min，冰水浴10 min，12 000 r/min离心1 min，取上清液为PCR反应模板，-20 ℃保存。普通PCR引物参照文献[3-4]合成，见表1。PCR扩增表1中的目的基因，PCR反应体系和条件按文献[5]操作。PCR反应体系为25 μL。PCR反应参数：95 ℃预变性3 min；92 ℃变性 30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，37个循环；72 ℃延伸40 s。扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，于120 V恒压电泳60 min，凝胶成像仪进行观察拍照。扩增产物由上海生工进行双向测序分析，测序引物同PCR分型引物，扩增仪器为ABI 3730XL测序仪。

表1 脑膜炎奈瑟菌PCR分型所需引物序列以及扩增片段长度

1.3.3多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST) MLST分型引物参考PubMLST数据库http://pubmlst.org/neisseria/imformation，用Primer软件进行设计,见表2。用提取好的脑膜炎奈瑟菌的反应模板，对7个管家基因进行PCR扩增，反应体系和条件同文献[5]。PCR反应体系为25 μL。PCR反应参数：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸2 min。扩增产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析。单一阳性条带产物由上海生工公司纯化后用相应的测序引物(见表2)进行双向测序，扩增仪器为ABI 3730XL测序仪。测序结果提交到PubMLST数据库，获取各管家基因的等位基因号，形成该菌株等位基因谱，判断其序列型(sequence type, ST)及所属的ST克隆系，方法见文献[5]。

表2 多位点序列分型引物序列及扩增产物长度

1.3.4药物敏感试验 取分纯后培养 24 h的脑膜炎奈瑟菌菌株于3 mL无菌生理盐水中，制备0.5麦氏浊度单位的菌液，均匀涂布在M-H平板上，每个平板粘贴2张抗菌药物纸片，置36.5 ℃、5% CO2培养24 h读取最低抑菌浓度(MIC)。试验同时用ATCC 49619和ATCC 25922作质控。结果判定按照2020年美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推荐标准[6]报告敏感、中介、耐药。

2 结果

2.1PCR分型鉴定 血培养标本中分离出的革兰阴性双球菌，经质谱仪鉴定为脑膜炎奈瑟菌。经PCR扩增结果显示，crgA阳性，siaD(C)阳性。见图1。经测序分析后可鉴定为C群脑膜炎奈瑟菌。

2.2MLST分型结果 成功扩增出7个管家基因，见图2。7个管家基因经DNA测序，测序结果经过PubMLST数据库比对，获得7个等位基因号分别为abcZ222、adK3、aroE58、fumC275、gdh30、pghC5、pgm255。该菌株的MLST分型为ST-4821型。

注：M，DNA marker；1，crgA；2，OrF-2；3，siaD(B)；4，siaD(C)；5，siaD(Y)；6，siaD(W135)。

注：M，DNA marker；1，abcZ；2，adk；3，aroE；4，fumC；5，gdh；6，pghC；7，pgm。

2.3药物敏感性试验结果 该菌株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南、阿奇霉素、氯霉素、利福平、米诺环素、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、萘啶酸均敏感。

3 讨论

目前，文献报道发现，欧美地区流行性脑脊髓膜炎流行的血清群主要为B群、C群、Y群，非洲流行性脑脊髓膜炎主要流行血清群为W群[7]。2003年以前我国流行性脑脊髓膜炎的流行血清群以A群为主，之后C群逐渐流行，A群自2010年以来病例明显减少，而出现B群及W群病例的地区呈增多的趋势，个别省份出现X群和Y群病例[8]。徐州市在2011年有一篇关于B群脑膜炎奈瑟菌感染导致的脑脊髓膜炎的文献描述[9]。本次实验室发现的脑膜炎奈瑟菌序列型是ST-4821型，同时是我国首次报道并被国际承认的重要流行克隆群，是国际上引起流行性脑脊髓膜炎流行的第7个具有高致病性的C群菌株亚群之一[10]。

据相关文献报道，在C群和B群的不同血清群脑膜炎奈瑟菌之间，比较容易发生荚膜间的转换，同时我国流行性脑脊髓膜炎流行虽然以A群和C群为主[11]，但B群也已相继出现[11-12]。我国现有的流行性脑脊髓膜炎疫苗有针对A群、A+C群、A+C+W135+Y群的，可针对性预防相应血清群流行性脑脊髓膜炎，但尚无B群疫苗[13]，所以应加强流行性脑脊髓膜炎病原及时监测，以便采取针对性的防控措施。

WHO一共推荐了12种抗菌药物用于临床流行性脑脊髓膜炎救治和流行性脑脊髓膜炎疫情发生后的重点人群预防性服药，根据相关研究，目前头孢噻肟、氨苄西林和青霉素作为一线药物在临床得到了广泛使用。全球范围内不断有青霉素耐药或不敏感菌株的报道，我国亦出现对青霉素耐药的脑膜炎奈瑟菌[14]。加强对于头孢噻肟、氨苄西林等抗菌药物尤其是青霉素的耐药性检测，了解耐药谱的变化趋势，对临床经验用药具有重要的指导意义。另外，磺胺类药物如磺胺甲基异噁唑，曾经作为临床救治和预防性服药首选药物，但2005年安徽出现C群脑膜炎奈瑟菌，对磺胺类药物均耐药，故磺胺类药物已不再推荐作为临床救治和预防性服药的首选药物。但本次临床分离出的C群脑膜炎奈瑟菌对临床常见的抗菌药物均敏感，包含磺胺类药物复方磺胺甲噁唑，不同于上述报道。本地区脑膜炎奈瑟菌的耐药谱与其他地区不同的耐药机制是下一步研究的方向。