电针对血管性认知障碍大鼠海马功能活动及其分子表达谱的影响

王泽宇，丁妍怡，戴雅玲，杨敏光，黄 佳，张胜行，3*

1 上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海 200025；

2 福建中医药大学康复医学院，福建福州 350122；

3 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建福州350025

血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是由脑血管病变及其危险因素导致的脑组织缺血缺氧或组织损伤等诱发的认知障碍综合征［1］。研究显示，阿尔茨海默病是痴呆的首要病因，血管性因素是痴呆的次要病因，但2019 年《美国心脏病学会杂志》研究报道显示，在东亚地区血管性因素是痴呆的主要病因［2］。血管性认知障碍在中医学中属于“痴呆”范畴，其病位在脑。《素问·脉要精微论》言：“头者，精明之腑。”头为诸阳，脑为元神之府，诸阳经皆上头与脑发生直接或间接的联系，与脏腑经络关系密切［3］。因此，针刺头穴可加强经脉之间的联系，激发经气，疏通经络，调整全身脏腑气血。研究证实，针刺“神庭”“百会”可激活认知功能相关脑区，包括额叶、颞叶、扣带回和海马等脑区，其中学习记忆功能改变与海马紧密相关［4-5］。学习和记忆、日常生活中的短期记忆都储存在海马体中，当海马区受损时会导致健忘。研究发现，针刺可以改善海马神经元损伤，在脑缺血中发挥神经保护作用［6］。针刺百会穴可显著增强脑缺血大鼠的海马神经元密度，改善其突触可塑性，进而改善认知行为。因此，针刺治疗VCI 很可能是通过改善海马功能实现的［7］。本研究采用小动物磁共振成像探讨电针“百会”“神庭”穴干预VCI大鼠海马功能活动情况，并利用Agilent mRNA 表达谱芯片分析电针调控的关键效应分子及其作用途径，以期为探究电针治疗血管性认知障碍可能的作用机制提供可借鉴的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选择雄性SPF 级SD 大鼠24 只，体质量（280±30）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供［生产许可证号码：SCXK（沪）2017-0005］，饲养于福建中医药大学实验动物中心［许可证号：SYXK（闽）2020-0002］。采用随机数字表法分为假手术组、模型组、电针组，每组8 只。本实验方案经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准号：FJTCM IACUC 2019036）。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型制备 采用双侧颈总动脉结扎法制备VCI大鼠模型［8］。模型组、电针组大鼠术前均禁食24 h，用2%戊巴比妥钠（0.2 mL/100 g）进行腹腔注射麻醉；分离左、右侧颈总动脉，采用不可吸收外科手术线结扎颈总动脉；手术后腹腔注射20 万U/mL青霉素钠溶液（0.05 mL/100 g）。假手术组大鼠仅分离双侧颈总动脉但不结扎。所有大鼠术后放置于26 ℃室温下等待其自然苏醒后再放回笼中饲养。

1.2.2干预方法 电针组大鼠术后第14 天，参考《实验针灸学》的方法选取大鼠百会、神庭穴进行电针干预。参数如下：疏密波，频率1/20 Hz，刺激强度1，电针干预30 min/次，1次/d，共干预28 d。假手术组、模型组大鼠每日同等抓取，但不进行其他干预。

1.3 观察指标

1.3.1空间学习记忆能力 采用Barnes 迷宫测试评价大鼠空间学习记忆能力。Barnes迷宫测试主要分为适应阶段、学习阶段、测试阶段3 个阶段［9］。在每次实验前用75%的消毒酒精擦拭平台、逃避盒各1遍，去除残留气味，并将第1层平台旋转，避免大鼠因为味道而找到逃避盒。记录逃避潜伏期、目标象限持续时间百分比。

1.3.2空间工作记忆能力 采用Y迷宫测试评价大鼠空间工作记忆能力。实验开始时将大鼠置于Y迷宫中央区域，让其在Y 迷宫中自由探索8 min，并记录其进入各臂的顺序，只有连续进入3 个不同的臂时计为1次正确的交替探索，待8 min结束后将实验动物拿出Y迷宫，并放回原笼饲养；然后将Y迷宫用消毒酒精擦拭1 遍，以去除残留气味的影响。交替率计算方法：Y 迷宫交替率＝正确交替次数/（总交替次数－2）×100%。

1.3.3脑区功能活动分析 采用小动物磁共振扫描仪（德国Bruker，7.0 T）对各组大鼠进行BOLDfMRI扫描。BOLD-fMRI扫描参数如下：回波时间＝28 ms，重复时间＝2 000 ms，视野大小＝32 mm×32 mm，重复次数＝1，图像矩阵大小＝128×128，层数＝21，层厚＝1 mm，no slice gap，时间点＝200，扫描时间＝6 min。

采用静息态功能磁共振数据处理助手软件包（Data Processing Assistant for Resting-State fMRI，DPARSF）和统计参数图（Statistical Parametric Map⁃ping，SPM）进行脑区局部一致性分析，数据处理包括去除前10个时间点、时间校正、头动校正、空间标准化、去线性漂移、滤波（0.01～0.1 Hz）、局部一致性（regional homogeneity，ReHo）值的计算和平滑处理。采用单因素方差分析进行各组大鼠脑区局部一致性变化比较。P＜0.005，clusters＞10 为差异具有统计学意义。

1.3.4基因表达谱分析 每组选择4 只大鼠提取左、右侧海马总RNA，采用Agilent mRNA 表达谱芯片分析海马差异mRNA 表达谱，包括体外扩增、荧光标记、芯片杂交和数据预处理分析以及Gene⁃Spring GX 软件计算基因表达差异分析，每个数据进行归一化和质控分析，采用Cluster 3.0 软件进行聚类分析和Circos图形化展示差异表达基因。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。数据服从正态分布采用（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法进行分析。P＜0.05视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组空间学习记忆能力比较

Barnes 迷宫空间探索试验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显更高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组逃避潜伏期明显更低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠目标象限持续时间百分比明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，电针组目标象限持续时间百分比明显增加（P＜0.05）。见表1～2。

表1 3组Barnes实验逃避潜伏期比较（） 秒Table1 Comparison of latency in Barnes maze in three groups（） s

表1 3组Barnes实验逃避潜伏期比较（） 秒Table1 Comparison of latency in Barnes maze in three groups（） s

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

表2 3组目标象限持续时间百分比比较（） %Table2 Comparison of the percentage of duration in the target quadrant in three group（） %

表2 3组目标象限持续时间百分比比较（） %Table2 Comparison of the percentage of duration in the target quadrant in three group（） %

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;com⁃pared with the model group,2)P<0.05.

2.2 3组空间工作记忆能力比较

Y 迷宫测试结果显示，与假手术组比较，模型组Y 迷宫交替率明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，电针组Y 迷宫交替率明显升高（P＜0.05）。这表明电针百会、神庭穴可以提升VCI 大鼠的Y 迷宫交替率，改善VCI大鼠空间工作记忆能力。见表3。

表3 3组干预后Y迷宫交替率比较（） %Table3 Comparison of the alternation rate of Y-maze after intervention in three groups（） %

表3 3组干预后Y迷宫交替率比较（） %Table3 Comparison of the alternation rate of Y-maze after intervention in three groups（） %

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;com⁃pared with the model group,2)P<0.05.

2.3 3组海马局部一致性比较

研究结果显示，与假手术组比较，模型组双侧海马、前额叶、纹状体及丘脑背外侧核等脑区的局部一致性明显减弱（P＜0.005）；与模型组比较，电针组双侧前额叶、海马及梨状皮层脑区的局部一致性明显增强（P＜0.005）。见表4、图1～2。

图1 模型组与假手术组脑区局部一致性比较Figure 1 Comparison of ReHo of brain regions between the model group and the sham operation group

表4 3组ReHo值比较Table4 Comparison of ReHo in three groups

图2 电针组与模型组脑区局部一致性比较Figure 2 Comparison of ReHo of brain regions between the electroacupuncture group and the model group

2.4 3组海马基因表达谱分析

海马组织基因表达谱芯片分析结果显示，与假手术组比较，模型组海马mRNA 差异表达＞2 倍的基因共705 个（P＜0.05），其中195 个基因（Sytl1、Chrna7、Gprc5a、Trpv6、Klhl14、Npsr1、Myh3、Galnt3、Nr4a1、Bmp3、Egr2等突触结构蛋白、乙酰胆碱受体、早期即刻基因相关分子）表达下调；510 个基因（In⁃sl6、Efcab1、Akr1b1、Tagln、Glrb、Akr1c13、Kcne1L、Ubap1 等炎症、氧化应激、趋化因子、自噬、凋亡、泛素化相关分子）表达上调。与模型组比较，电针组海马mRNA差异表达＞2倍共399个基因（P＜0.05），其中166 个基因（Klhl14、Bmp3、Npsr1、Cacna1e 等钙通道蛋白、能量代谢、免疫调节相关分子）表达上调；233个基因（Insl6、Ube2k、Cdkn1c、Camp、Upk1b等炎症、细胞周期抑制、泛素化相关分子）表达下调。见图3～5、表5。

表5 2组比较部分差异mRNA表达结果Table 5 Differential mRNA expression results in the pair⁃wise comparison

图3 3组海马mRNA差异表达的聚类分析Figure 3 Cluster analysis of differential expression of hippocampal mRNA in three groups

3 讨论

血管性认知障碍多发于60岁以上老年人群，其发病率高达24.2%［10］。寻找治疗血管性认知障碍的适宜治疗方案是当前的研究热点。针灸作为血管性认知障碍的一种行之有效的康复方法，朱永磊等［11］采用“从督论治”针刺法治疗脑卒中后认知功能障碍40例，发现“从督论治”针刺可显著提高简易精神状态评分。本研究团队前期研究提出“脏腑为用、督脉为枢”促进认知功能恢复的中医康复理论，结合中医古籍梳理，提出了“通督调神”针刺“百会”“神庭”穴作为治疗认知障碍的针刺康复方案，经临床随机对照试验证实，“通督调神”针刺“百会”“神庭”穴可改善血管性认知障碍患者整体认知功能和记忆功能［12-13］。

3.1 电针可以改善VCI大鼠认知功能障碍

图4 模型组与假手术组海马mRNA差异表达情况Figure 4 Differential expression of hippocampal mRNA in the model group compared with the sham op⁃eration group

图5 电针组与模型组海马mRNA差异表达情况Figure 5 Differential expression of hippocampal mRNA in the electroacupuncture group compared with the model group

血管性认知障碍会导致多种类型的认知功能受损，主要集中于学习记忆功能及工作记忆功能受损［14-16］。本研究通过对VCI大鼠进行认知功能行为学的检测，发现VCI 大鼠在Barnes 迷宫实验中逃避潜伏期上升，随后的空间探索实验中，VCI大鼠搜寻逃避盒的轨迹杂乱无章，无法明确定位逃避盒所在的象限，而在Y 迷宫测试中，VCI 大鼠交替率显著下降，表明VCI 大鼠出现空间学习记忆与工作记忆功能障碍，这与其他研究结果类似［15，17］。电针刺激百会、神庭穴后，VCI大鼠在Barnes 迷宫的逃避潜伏期明显下降，其探索逃避盒所在区域的停留时间也明显升高，这提示电针百会、神庭穴可以改善VCI大鼠的空间学习记忆功能；此外，本研究Y迷宫交替率测试也发现电针百会、神庭穴可以改善VCI 大鼠空间工作记忆功能，与前期研究相一致［18］。目前大部分关于电针改善VCI大鼠认知功能障碍的研究认为其可能的机制在于调控相关脑区的蛋白质表达进而改善认知功能［7-8］，而未对电针调控蛋白质改变后相关脑区功能活动的变化进行更深入的探索。因此，本研究拟利用BOLD-fMRI 技术进一步揭示电针干预后VCI大鼠脑区功能活动的直接变化。

3.2 电针可以调控VCI大鼠脑区功能活动

局部一致性信号的强弱作为脑区功能活动高低的敏感性指标之一，检测脑区血流信号在时间序列上的一致性，通过脑部的血流信号可以间接反映神经元活动的强弱［19］。本研究结果显示，大鼠双侧颈总动脉结扎42 d 后，其双侧海马、前额叶、纹状体及丘脑背外侧核均出现脑区活动局部一致性信号下降，这提示模型组大鼠在前额叶、海马、纹状体及丘脑背外侧核均出现了神经元活动减弱，这些脑区神经元活动性的降低可能是VCI大鼠认知功能下降的重要因素，与NATION 等［20-21］研究结果相似。而电针干预后海马、前额叶、杏仁核及梨状皮层均出现局部一致性信号上升，表明电针可以有效增强海马、前额叶及梨状皮层等脑区神经元活动，恢复由全脑低灌注导致的神经元功能缺损。海马是调节记忆编码和储存的关键脑区，海马内含有一类可以根据动物在环境中特定位置而放电的位置细胞［22］。腹侧、背侧海马与前额叶皮层神经活动可以诱发theta 同步振荡，从而调节空间记忆任务［23］。海马-前额叶神经环路参与了学习记忆与工作记忆功能的调控，其具体调控可能与该环路的亚区以及细胞类型有关［24-25］。本研究BOLD-fMRI 结果提示，电针很可能通过调控海马、前额叶脑区活动改善血管性认知障碍空间学习记忆与工作记忆功能。

3.3 电针可以调控VCI大鼠海马基因表达

既往研究表明，血管性认知障碍损伤的分子生物学机制极其复杂，与突触结构、功能相关蛋白丢失，神经炎症、细胞凋亡等相关分子表达异常密切相关［8，26］。研究表明，针刺可改善脑缺血损伤引起的认知缺陷，抑制海马氧化应激、神经元凋亡损伤，通过上调Trx-1 表达，抑制ASK1-JNK/p38 通路，降低IL-6 表达，促进钙离子释放相关蛋白、突触相关蛋白NMDA 受体、AMPA 受体等［7，27-28］。本研究通过全基因组芯片分析发现，电针增强血管性认知障碍大鼠海马Klhl14、Bmp3、Npsr1、Cacna1e 等钙通道蛋白、能量代谢、免疫调节相关分子的166 个基因表达，并抑制Insl6、Ube2k、Cdkn1c、Camp、Upk1b 等炎症、细胞周期抑制、泛素化相关分子的233个基因表达。这说明，电针干预后VCI 大鼠多个通路的相关基因表达发生改变，提示其电针存在调控后续相关蛋白表达的可能性。但针刺治疗血管性认知障碍的具体机制较为复杂，很可能是通过多靶点、多途径发挥作用，下一步还需要开展更深入、全面的研究探讨相关通路对于脑区功能活动的具体调控作用。

4 小 结

本研究证实电针百会、神庭穴可以改善血管性认知障碍大鼠认知功能，其机制可能与增强海马、前额叶等脑区功能以及调控钙离子、能量代谢相关分子的表达参与调节神经活动等有关，但其具体机制还有待进一步研究。