基于网络药理学及分子对接探讨黄连治疗2型糖尿病的作用机制

刘慧玲，谭定英，黄 敏，陈平平，张 望

1 广州中医药大学医学信息工程学院，广东广州 510006；

2 广州中医药大学第二附属医院，广东广州540120

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病，据调查数据显示：我国20 岁以上的人群患病率为9.7%［1］。糖尿病及其并发症对人体有极大的伤害，目前关于糖尿病并发症的研究主要集中在糖尿病心血管病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病自主神经病变和糖尿病肾病［2］。中医学认为，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）及其并发症的病因病机为湿热内盛、阴虚燥热、痰瘀阻络［3］，治疗以清热燥湿、养阴清热、化痰通络为主。中药具有“多成分-多靶点-多通路”的特点，目前广泛应用于糖尿病的治疗，且临床疗效显著［4］。黄连具有清热燥湿功效，能有效改善2型糖尿病患者临床症状，降低血糖，疗效肯定。但是，目前对黄连治疗2型糖尿病的具体药效基础及作用机制尚未明确［5］。为此，本研究通过网络药理学及分子对接筛选黄连的活性成分及作用靶点，探讨其治疗2型糖尿病多成分-多靶点-多通路的药理学作用机制，以期为黄连治疗2型糖尿病提供依据。

1 资料与方法

1.1 黄连活性成分筛选与靶点预测

以“黄连”为关键词，利用中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems phar⁃macology database and analysis platform，TCMSP）、UniProt 蛋白质数据库，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件［6-7］，获取黄连的活性成分，并从TCMSP数据库中筛选出对应的靶点。

1.2 2型糖尿病相关基因及黄连潜在作用靶点预测

以“type 2 diabetes mellitus”为关键词，在毒性与基因比较数据库（comparative toxicogenomics database，CTD）检索疾病相关基因，去掉重复靶点，并使用韦恩图获取黄连活性成分及2型糖尿病疾病的共同靶点，即为黄连作用于2型糖尿病的潜在作用靶点。

1.3 黄连-活性成分-潜在作用靶点网络构建

采用Cytoscape 3.6.1 软件将黄连活性成分与潜在作用靶点导入，构建“黄连-活性成分-潜在作用靶点”网络，并使用Network Analyzer 插件进行网络拓扑分析，得出黄连作用于2 型糖尿病的主要潜在靶点。

1.4 构建蛋白质相互作用网络

将共同靶点导入STRING 分析平台，构建黄连治疗2 型糖尿病的蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。设定研究物种为“Homo sapiens”，蛋白相互作用阈值（medium confidence）＞0.900［8］，选择K-means聚类分析，并将分析结果导入Cytoscape3.6.1软件中进行拓扑分析，得出黄连作用于2 型糖尿病的核心靶点。

1.5 生物信息学分析

采用DAVID 和Hiplot 科研数据可视化平台对黄连治疗2 型糖尿病的20 个核心靶点进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and ge⁃nomes，KEGG）信号通路分析，设定P＜0.01，并分析治疗2型糖尿病的主要通路。

1.6 分子对接

选择PPI 拓扑分析筛选所得的核心靶基因及其对应的活性成分进行半柔性分子对接，利用Pub⁃Chem 数据库得到黄连活性成分的2D 结构信息，用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117 软件转换为3D 结构并优化最小自由能，使用PDB 数据库查找靶蛋白，利用AutoDockTools 1.5.6 软件分别对小分子（活性成分）和对接受体（靶蛋白）进行预处理，包括删去靶蛋白晶体结构中的配体分子和水分子，加氢、加电荷、赋予原子类型。结合位点定义及格点参数计算，设置构象搜索方法与对接参数并输出dpf 格式文件，进行分子对接计算，获得黄连的活性分子与靶蛋白的对接结果，将50个构象按能量排序查看结果，存储最优构象即结合能最小的构象。利用Py⁃MOL 2.4.1打开查看对接图像，绘制靶蛋白与小分子相互作用图，观察其结合模式以及与周边氨基酸残基的相互作用。活性成分与靶蛋白之间相互作用强度大小可用对接分数表示，该数值为负数提示该活性成分能与靶标自由结合，数值越小表示结合度越好。一般认为当结合亲和力（binding affinity）＜-7.0 kcal/mol（1 kca/mol＝4.186 kJ/mol）时说明活性分子与靶蛋白有强烈的结合活性［9］。

1.7 引用和参考的数据库

见表1。

表1 参考数据库Table 1 Collections of database

2 结果

2.1 黄连活性成分及其靶点预测结果

根据筛选条件OB≥30%、DL≥0.18 从TCMSP 数据库筛选出黄连活性成分14 种，见表2。通过TC⁃MSP 中的Related Targets 进行筛选、删除重复项，获得黄连对应的有效靶点189 个，并利用UniProt 蛋白质数据库进行匹配，得到对应的靶点基因。

表2 黄连活性成分Table 2 Active ingredients of Coptis chinensis

2.2 获取黄连的潜在作用靶点

以“type 2 diabetes mellitus”为关键词，在CTD数据库进行基因检索，检索到与T2DM 相关的疾病基因有9 813 个，利用韦恩分析，得出黄连治疗T2DM的潜在作用靶点136个。筛选出小檗碱、槲皮素、氢化小檗碱等主要活性成分对应的靶点见表3。

表3 黄连主要活性成分及其对应靶点Table 3 Main active ingredients and corresponding targets of Coptis chinensis

2.3 黄连-活性成分-潜在作用靶点网络

黄连-活性成分-潜在作用靶点网络见图1。其中，绿色节点即为黄连，黄色节点为黄连的各活性成分，其余蓝色节点为活性成分对应的潜在作用靶点，体现中药“多成分-多靶点”的特点。该网络由151 个节点，146 条边构成，平均度值（degree）为2.04。以各节点的度值（degree）大小进行排序，在网络中活性成分的度值较高则可能为核心节点。如槲皮素（degree＝102）、氢化小檗碱（degree＝16）、小檗碱（degree＝13）、小檗浸碱（degree＝4）、巴马汀（degree＝4），这些可能是黄连发挥药效的主要活性成分。而靶点度值较高NOS2（degree＝2），PTGS2（de⁃gree＝2）、RXRA（degree＝2）、ADRA1D（degree＝2），则可能为黄连治疗2 型糖尿病的主要潜在作用靶点。

图1 黄连-活性成分-潜在作用靶点网络Figure 1 Coptis chinensis-active ingredient-potential target network

2.4 黄连治疗2型糖尿病的潜在作用靶点PPI网络分析

将黄连的潜在作用靶点导入STRING 平台构建PPI 网络，设置高置信度（high confidence<0.900>），隐藏无连接的靶点，见图2。

图2 蛋白质相互作用（PPI）网络Figure 2 Protein interaction(PPI)network

STRING 根据与其相互作用的score值对颜色进行映射。不同颜色的边代表不同相互作用类型，紫色的边表示2 个节点之间的联系已通过实验验证（experimentally determined），绿色代表基因相邻（gene neighborhood），红色代表基因融合（gene fusions），深蓝色代表着基因共现（gene co-occurrence），淡蓝色则表示二者蛋白质同源（protein homology）。将所得PPI数据导入Cytoscape 3.6.1软件进行可视化分析，该PPI网络包含有136个节点，415 条边，经Network An⁃alyzer 拓扑分析后，以各靶点的度值（degree）大小进行排序，前20 名的基因见表4。由此预测前20个靶点可能是黄连治疗2型糖尿病的核心靶点。

表4 作用靶点的拓扑学分析结果（度值排名前20）Table 4 Topological analysis results of action targets（top 20 in degree value ranking）

2.5 黄连治疗2型糖尿病的GO富集分析

对黄连作用于2 型糖尿病的20 个核心靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）功能富集分析。富集分析后共获得2 485 个条目，其中，生物过程（biological process，BP）有2 243个、分子功能（molec⁃ular function，MF）有152 个、细胞组成（cellular com⁃ponents，CC）共有90 个，见图3。在BP 方面主要涉及腺发育、上皮细胞增殖、DNA 结合转录因子活性的调节、氧化应激及对脂多糖等多种细胞凋亡反应。在MF 方面主要涉及DNA 转录因子结合、酶结合、受体结合等。在CC 方面主要涉及酶调节复合物、囊腔、膜筏、膜微区、膜区的构成。由此表明，黄连可调控多种生物反应参与治疗2型糖尿病。

图3 GO富集分析结果Figure 3 GO enrichment analysis results

2.6 黄连治疗2型糖尿病的KEGG通路富集分析

采用DAVID、Hiplot 数据库对20 个核心靶点进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，设定生物信息通路P＜0.01，KEGG 通路富集共得到187 条通路，其中具有显著意义的有137条，按通路中含有的基因数量进行排序，前20 条显著通路信息见表5。黄连参与调控2型糖尿病主要有MAPK、糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）-RAGE、PI3K-Akt、Toll 样受体、HIF-1 及TNF 信号通路，参与调控的基因靶点主要有丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、肿瘤抗原p53（TP53）、转录因子AP-1（JUN）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）等。一条通路含有多个靶点，一个靶点也参与了多条通路，这表明黄连治疗2 型糖尿病可能与其“多靶点-多通路”的作用机制有关。

表5 黄连治疗2型糖尿病的KEGG通路信息Table 5 KEGG pathway information of Coptis chinensis in the treatment of type 2 diabetes

2.7 分子对接及结合自由能分析

本研究选取黄连作用于2 型糖尿病的20 个核心靶点与黄连的2 个有效成分进行分子对接，以验证黄连活性成分与靶点的对应关系，通过结合自由能判断分子间的结合能力。结果显示，20 组对接结果的结合能均＜-7 kcal/mol。见表6、图4。

图4 分子对接三维图Figure 4 Three dimensional view of molecular docking

表6 分子对接结果Table 6 Results of molecular docking

3 讨论

本研究使用网络药理学的研究方法，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 筛选出小檗碱、槲皮素等14 种活性成分，对应189 个有效靶点。通过建立“黄连-活性成分-潜在作用靶点”网络，根据各活性成分的degree值，排序较前的活性成分主要有槲皮素、氢化小檗碱、小檗碱等。槲皮素药理活性广泛，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂等药理学作用多种生物活性［10］，可能在预防和治疗糖尿病中发挥作用。小檗碱具有抗菌、抗病毒、降血糖、降脂、改善胰岛素抵抗、调节慢性炎症、抗微生物等药理学作用［11-12］。分子对接结果显示，小檗碱、槲皮素与靶基因具有良好的结合作用，提示本次所筛选出的黄连主要活性成分，其治疗2 型糖尿病具有一定的药理学基础。

本研究PPI网络分析结果显示，黄连治疗2型糖尿病的作用核心靶点主要有MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6。分子对接结果显示，黄连的主要活性成分和靶点之间的结合构型具有强烈的活性，如槲皮素与EGF、IL-1β、TNF、MAPK1、IL-6 等蛋白形成较好的对接模式与较高亲和力。这提示这些核心靶点均可能是黄连治疗T2DM 的潜在作用靶点。KEGG 通路富集分析显示，参与调控主要通路有MAPK、AGEs-RAGE、PI3K-Akt、Toll样受体、HIF-1、TNF等信号通路。每个基因靶点作用于多条信号通路，推测黄连是通过调控以上靶点来发挥治疗2 型糖尿病的作用。综合GO 功能与KEGG 通路富集分析结果，提示黄连治疗2 型糖尿病是一个相对复杂的作用机制。这可能与以下因素有关。

3.1 调控糖脂代谢

在KEGG 通路富集分析中，MAPK 信号通路的显著性最高，富集了14 个基因靶点数。MAPK 为生物能量代谢调节的关键分子，可调节机体糖、脂代谢。在高糖状态下，由多种因素激活MAPK 信号转导通路，参与机体糖脂代谢的调控［13］。有氧运动可以抑制或减轻机体胰岛素抵抗发生，而MAPK 可能是有氧运动抑制或改善胰岛素抵抗的另一重要因子［14］。小檗碱可以通过改善氧化应激，在一定程度上增加胰岛素的表达以及β 细胞的再生，激活各种组织如脂肪、肌肉中的MAPK信号通路，从而降低血糖水平［15］。PI3K-Akt 信号通路是胰岛素信号转导的主要途径，在糖脂代谢中扮演重要角色，其可通过介导生长因子，从而对葡萄糖稳态和脂质代谢起调控作用［16］。这提示，黄连治疗2 型糖尿病可能与调控糖脂代谢有关。

3.2 调控炎症反应

2 型糖尿病是自然免疫和先天性疾病，是一种慢性低度炎症状态，炎症是诱发2 型糖尿病的重要因素之一。本研究富集分析结果显示，黄连可通过调控多个生长因子（EGFR、VEGFA、TNF 等）及炎症因子（IL-6、IL-1β），参与调控MAPK、Toll 样受体、TNF 等信号通路。TNF-α 是一类能造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，具有广泛的生物学效应，其能够介导MAPK 信号通路，促进IL-1、IL-6、CRP 等多种促炎介质的产生，从而启动炎症级联反应［17］。Toll样受体为机体免疫防御系统的重要一环，其可通过对病原相关分子模式识别来调节免疫应答与炎症反应，对T2DM 患者的炎性反应、胰岛素抵抗有明显的调控效果［18］。本研究认为黄连的作用靶点主要为MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6，其有效成分小檗碱可能通过参与MAPK、Toll 样受体等信号通路的调控而抑制慢性炎症，进而缓解异常代谢和胰岛素抵抗，这与操映倩等［19］研究结果一致，但其认为小檗碱是与Hsp90b1、Pdia6、Prdx5、Pdia4、Itgam、PTGS1、NOS2、IL-10 等靶点相互作用，从而调控炎症反应的观点与本研究结果存在一定差异。

3.3 调控细胞增殖与凋亡

AGEs-RAGE 通路可调控胰岛细胞凋亡、功能受损的过程。本研究KEGG 通路富集分析显示，AGEs-RAGE 信号通路富集了MAPK1、AKT1、JUN、TNF、IL-6 等11 个基因靶点，是显著性较高的通路。当AGEs 水平升高时，可通过上调胰岛细胞表面RAGE 受体表达，激活氧化酶而使核因子κB（NFκB）表达增高，从而导致胰岛细胞凋亡［20］。PI3KAkt 信号通路也是机体内细胞增殖、分化、凋亡的重要信号通路，可对糖尿病血管并发症的发生发展发挥调控作用。本研究显示，小檗碱可通过调控PI3KAkt 信号通路，抑制细胞增殖，从而影响糖尿病血管病变，与朱昌国等［21］研究结果相似。

3.4 促进氧化应激

氧化应激贯穿于糖尿病并发症发病机制的始终。糖尿病患者糖基化终产物（AGEs）升高，与受体结合后促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，产生氧自由基，细胞膜发生超氧化，使维持离子状态的膜蛋白功能受损，最终导致细胞结构、功能、代谢异常，诱发氧化应激反应［22］。HIF-1α 作为调节细胞内氧代谢的关键因子之一，是目前发现的唯一能在特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，对糖尿病及其并发症的发生、发展起促进作用［2］。本研究KEGG 通路富集分析显示，HIF-1 信号通路在GO 分析中的BP 环节准确度较高，富集了TNF、MAPK1 等9 个基因靶点。而黄连有效成分可作用于上述基因靶点，调控HIF-1信号通路，从而调节机体氧化应激反应，达到治疗糖尿病及其并发症的目的。

4 结语

本研究从网络药理学和分子对接角度证实黄连治疗2 型糖尿病是一个相对复杂的过程，其主要活性成分为槲皮素、小檗碱等，可能通过作用于MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6 等相关靶点，参与调控MAPK、AGEs-RAGE、PI3K-Akt、Toll 样受体、HIF-1、TNF 信号通路，通过调控糖脂代谢及炎症反应、调控细胞增殖与凋亡、促进氧化应激等多方面以发挥治疗2型糖尿病及其并发症的作用。但本研究仍存在一些不足之处，如仅预测定制药物化学成分作用靶点，没有对靶点进行上调和下调的预测，未能预测功能改变的方向。下一步将通过实验验证网络药理学筛选出来的黄连主要活性成分与关键靶点的级联效应，为黄连治疗2 型糖尿病提供进一步依据。