响应面优化超声辅助提取芥蓝多酚工艺研究

黄晓梅 谢丹丹 陈 昕 石丽荣 胡杰华 冯晨 曾瑞娟

摘 要：采用超声辅助法提取芥蓝多酚，并通过响应面法对提取工艺进行优化。以液料比、乙醇浓度、超声温度和超声时间4个因素进行单因素试验，在此基础上，以芥蓝多酚提取率为响应值，应用Box-Behnken法进行四因素三水平的试验设计和优化，得到芥蓝多酚最佳的提取工艺条件为液料比38mL/g、乙醇浓度61%、超声温度63℃和超声时间34min。此时芥蓝多酚提取率为15.03mg/g，与该模型的预测值（15.18mg/g）相比，两者相对误差为0.99%，说明该回归模型得到的提取工艺参数可靠，准确性较高，可以利用响应面法优化芥蓝多酚的提取。研究结果为芥蓝多酚的提取与开发提供了新的方向。

关键词：芥蓝;多酚;响应面;超声辅助;优化

中图分类号 TS255 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）23-0030-06

Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Polyphenols from Chinese Kale Using Response Surface Methodology

HUANG Xiaomei et al.

（Xiamen Ocean Vocational College， Xiamen 361100， China）

Abstract： Ultrasound-assisted extraction of polyphenols from Chinese kale was used in this experiment， and the extraction process was optimized by response surface methodology. Single factor experiments were carried out with four factors： liquid-to-material ratio， ethanol concentration， ultrasonic temperature and ultrasonic time. On this basis， with the extraction rate of Chinese kale polyphenols as response value， Box-Behnken was used to design and optimize the experiment at four factors and three levels. The optimum extraction conditions of Chinese kale polyphenols were obtained as follows： 38 mL/g of liquid-solid ratio， 61% of ethanol concentration， 63℃ of ultrasonic temperature， 34 minutes of ultrasonic time. The extraction yield of Chinese kale was 15.03 mg/g， compared with the best predictive value of the model （15.18mg/g）， the relative error was 0.99%， which indicated that the extraction process parameters obtained by the regression model were reliable and accurate. Response surface methodology could be used to optimize the extraction of polyphenols in Chinese kale， which provided a theoretical basis and a new direction for the extraction and development of polyphenols in Chinese kale.

Key words： Chinese kale; Polyphenols; Response surface methodology; Ultrasonic assisted; Optimization

芥蓝（Brassica alboglabra L.H. Bailey）又被称为绿叶甘蓝、盖菜，作为甘蓝的一个变种，是十字花科类的重要植物，也是我国著名的特色蔬菜之一[1-2]。芥蓝甜脆味美，所含有的营养价值和药用价值较高。芥蓝中含有的营养成分种类丰富，如维生素C、纤维素、糖类、多酚等，具有消暑解热、软化血管、预防心脏病等多种作用[3-4]。其中多酚是存在于植物的叶片、根、皮、壳和果肉中的一种酚类化合物的复杂次级代谢产，具有很多生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、抑制心血管疾病以及抗骨质疏松等，已广泛应用于农业、医学、食品、日化等相关领域中，发挥着至关重要的作用[5]。

本研究以芥蓝为原料，采用超声波强化辅助提取芥蓝中的多酚，在单因素试验基础上，研究液料比、乙醇浓度、超声温度和超声时间等4个因素对芥蓝多酚提取率的影响，并结合响应面法进行优化，得到了最佳的提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 原料为芥蓝，用蒸馏水将采购的芥蓝浸泡洗净，去除泥沙，晾干后切碎平铺在50 ℃鼓风干燥箱中进行烘干，然后取出进行粉碎，选择60目筛，过筛后保存备用。

1.1.2 試剂 福林酚试剂，自制;没食子酸，分析纯，天津瑞金物化学品有限公司;食用酒精（乙醇），食品医药级，河南浩宇食品添加剂有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备 BS224S电子天平;HH-2数显恒温水浴锅，金坛市新航仪器厂;WKYIII-100微量移液器，上海邦西仪器科技有限公司;KQ-100TDE型高频数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司;UV-7504（A）型紫外/可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作 采用福林-酚法[6]，按文献方法以没食子酸为标准品，并在765nm波长处测定标准品的吸光度值。将不同体积的0.1mg/mL的没食子酸标准溶液分别按0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL和0.5mL的福林-酚试剂加入10mL容量瓶中，充分混合均匀，静置1min，再加入1.5mL 20%的碳酸钠溶液后用蒸馏水定容至10mL，然后将容量瓶放置于75℃水浴锅中反应10min后取出，待冷却后测量其在765nm波长处的吸光度值。根据上述试验数据绘制标准曲线，该标准曲线以没食子酸浓度（mg/L）为横坐标，以各个样品所测量的吸光度值为纵坐标。

1.2.2 芥蓝多酚的提取工艺 准确称取1g芥蓝粉末，装进100mL的圆底烧瓶中，加入一定量的乙醇、沸石，装上回流装置，然后置于超声清洗器中进行超声回流提取，提取结束后过滤得滤液，移取1mL进行稀释一定倍数后备用。

1.2.3 多酚含量的测定 根据福林-酚法，量取1mL经稀释一定倍数后的提取液于10mL容量瓶中并定容，再按照标准曲线的测定方法测定提取液在765nm波长处的吸光值。根据标准曲线和测得的样品吸光值计算出样品中芥蓝多酚的浓度，通过回归方程计算得到芥蓝多酚的提取率。其计算公式如下：

多酚提取率（mg/g）=[C×N×VM×103×100] （1）

式中：C为芥蓝多酚质量浓度（mg/L）;V为提取液体积（mL）;N为稀释倍数;M为芥蓝叶质量（g）。

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 液料比 准确称取1g芥蓝叶粉末，分别加入不同体积的60%乙醇25、30、35、40和45mL，置于60℃的超声波清洗器中浸提，浸提时间为35min。浸提结束后取出冷却，取其上清液进行定容，考察不同液料比对芥蓝多酚提取率的影响，确定最佳液料比。

1.2.4.2 乙醇浓度 准确称取1g芥蓝粉末，分别加入不同浓度的乙醇溶液35mL，其浓度分别为50%、55%、60%、65%、70%（体积分数）。然后置于60℃的超声波清洗器中浸提，浸提时间为35min。浸提结束后取出冷却，取其上清液进行定容，考察不同乙醇浓度对芥蓝多酚提取率的影响，确定最佳乙醇浓度。

1.2.4.3 超声温度 准确称取1g芥蓝叶粉末，加入35mL 60%的乙醇，然后分别在不同温度的超声波清洗器中浸提，温度分别为50℃、55℃、60℃、65℃、和70℃。浸提时间为35min。浸提结束后取出冷却，取其上清液进行定容，考察不同超声温度对芥蓝多酚提取率的影响，确定最佳超声温度。

1.2.4.4 超声时间 准确称取1g芥蓝叶粉末，加入35mL 60%的乙醇，在60℃的超声波清洗器中浸提，浸提时间分别为25、30、35、40和45min，考察不同超声时间对芥蓝多酚的提取率的影响，确定最佳超声时间。

1.2.5 响应面优化试验设计 选择液料比（A）、乙醇浓度（B）、超声温度（C）和超声时间（D）4个因素进行单因素试验。在此基础上，以芥蓝多酚的提取率为响应值，基于Box-Behnken的设计原理进行四因素三水平的试验设计，并优化该试验得到的芥蓝多酚的提取工，具体因素与水平如表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对芥蓝多酚提取率的影响 由图1可知，当液料比在20～30mL/g，芥蓝多酚的提取率变化较为明显，液料比不断增大时，提取率不断增加，原因是液料比的增加使芥蓝中的多酚和溶剂之间的浓度差不断加大[7]，而且原料与溶剂之间的接触面积不断增大，因此芥蓝多酚的提取率会不断增加。当液料比为30mL/g时，原料与溶剂之间结合充分达到饱和，芥蓝多酚提取率得到最大。然而当液料比过大时，过量的溶剂会导致其他物质过度溶出，与多酚竞争，导致提取率降低。因此，综合考虑到降低能耗、成本等方面情况，较为合适的料液比选择为30mL/g。

2.1.2 乙醇浓度对芥蓝多酚提取率的影响 由图2可知，当乙醇浓度在50%～60%，随着其浓度的不断增大，芥蓝多酚的提取率也明显逐渐提高。提取率在乙醇浓度为60%时取得最大值。超过60%后，芥蓝多酚的提取率随着乙醇浓度的增加而逐渐降低。这是因为当乙醇浓度过低时，提取剂中有较高比例的水，会使得糖类等水溶性物质过量溶解[8]，从而降低多酚得率。而且乙醇浓度的增大会降低了溶剂的极性，使得芥蓝颗粒内多酚与蛋白质、多糖等物质间的氢键更容易被破坏，从而提高多酚提取率;但当乙醇浓度过高时，材料的脂溶性物质会过量溶出[9]，而且因溶剂的极性较弱，会大大增加芥蓝颗粒中的醇溶性物质的竞争性溶出，阻碍多酚溶出。较为合适的乙醇浓度选择60%。

2.1.3 超声温度对芥蓝多酚提取率的影响 由图3可知，当超声温度在50～60℃，芥蓝多酚的提取率随着超声温度的升高逐渐提高，超声温度为60℃时，多酚提取率最大。原因是超声温度的逐渐升高，慢慢加大了分子的平均动能，多酚的溶出与扩散加快，使芥蓝多酚提取率不断提高。而温度过高时多酚类物质会发生氧化[10]，多酚物质结构被破坏，并且过高的温度会导致溶剂更容易挥发，造成损失，以及芥蓝中其他成分更容易过量溶出，从而使得提取率降低。较为适宜的超声温度选择60℃。

2.1.4 超声时间对芥蓝多酚提取率的影响 由图4可知，当超声时间在20～35min，超声时间的不断增加，芥蓝多酚的提取率也逐渐提高，芥蓝多酚提取率在超声时间为35min时达到最大值。由Fick扩散定律可知，在一定范围内，超声波时间越长提取率越高，多酚提取率与超声时间成正比[11]。所以当超声时间的不断增加时，芥蓝中的多酚会逐渐溶出，不断提高芥蓝多酚的提取率，但當超声时间过长时，超声波的空化作用、机械及剪切效应会使多酚发生氧化、聚合等副反应而被破坏[12]，芥蓝多酚的提取率也不断降低。较为合适的超声时间为35min。

2.2 芥蓝多酚提取的响应面优化试验结果

2.2.1 响应面设计及结果分析 在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken方法设计出四因素三水平试验，结果如表2所示。使用Design Expert 8.05b软件对表2的试验数据进行响应面分析，方差结果如表3所示。

分析根据Box-Benhnken试验设计方法所获得的29组试验结果，在液料比（A）、乙醇浓度（B）、超声温度（C）和超声时间（D）4个单因素试验的基础上，得到以芥蓝多酚提取率（Y）为响应值的四元二次回归模型：

Y=14.97+0.54A-0.43B+0.17C-0.087D-0.035AB+0.19AC-0.045AD+0.35BC-0.17BD-0.17CD-0.55A2-0.38B2-0.39C2-0.51D2

用方差分析上述的回归模型，用以检验试验所考察的各种因素对芥蓝多酚提取率的影响，其结果见表3。然后使用F检验来确定响应值受回归方程中各变量影响的显著性。由表3可知，该回归模型的F=10.34，P<0.0001，这说明该模型极显著，同时该方程的相关系数R2=0.9118，说明该模型的预测值与试验值的相关性较高，拟合度较好，该回归模型可以用来预测与解释超过91%的试验值;该模型的失拟度F=4.18，P=0.0902>0.05，说明其拟合度良好，差异不显著，具有较小的试验误差;变异系数（C.v.%=1.71）<5%，说明该模型具有较好重复性。根据分析F及P值可以得到本试验所考察的芥蓝多酚提取率受4个因素的影响顺序分别为：液料比>超声温度>提取时间>乙醇浓度。其中一次项A，二次项A2、B2、C2、D2影响极显著（P<0.01），一次项C，交互项BC，有显著影响（P<0.05）;一次项B、D，交互项AB、AC、AD影响不显著（P>0.05）;说明芥蓝多酚的提取率受各因素的影响不是简单的线性关系。综合上述试验结果分析可知，试验所得的回归模型的准确度和可靠性较高，可以较好地描述各因素与响应面值之间的关系，可以用来对芥蓝多酚的提取率进行预测和分析。

2.2.2 响应曲面图分析 试验所得的响应面曲面图和等高线图如图5～10所示，本试验所考察的芥蓝多酚的提取率受液料比、乙醇浓度、超声温度和超声时间等4个因素之间的两两交互作用的影响，能从图中响应面曲面的坡度和等高线的疏密来反映出。结合三维响应曲面与二维等高线可分析出几个自变量对响应值的影响情况，等高线中椭圆的离心率越大，响应面中图形的曲线越陡，说明其交互作用影响越显著。

从下列图中可知响应曲面坡度最陡和等高线最密的是BC，也就是说乙醇浓度和超声温度的交互作用对芥蓝多酚的影响最为显著。而AC的响应曲面坡度最陡程度次之，等高线最密程度也次之，说明对芥蓝多酚的影响程度次之的是液料比和超声温度的交互作用。同理可知，本试验所考察的芥蓝多酚提取率受到各因素之间的交互作用的影响显著性的顺序为：BC乙醇浓度和超声温度>AC液料比和超声温度>CD超声温度和超声时间>BD乙醇浓度和超声时间>AD液料比和超声时间>AB液料比和乙醇浓度。

2.3 最佳工艺条件的确定与验证 通过分析已建立的回归模型，得到本试验中芥蓝多酚的最佳提取工艺如下：液料比37.94mL/g、乙醇浓度61.01%、超声温度62.56℃、超声时间33.85min，在此条件下，芥蓝多酚提取率的预测值为15.18mg/g。为验证该回归方程的准确性，对得到的最佳工艺进行检验，并且为了试验便利，修正各工艺条件，选取液料比为38mL/g、乙醇浓度为61%、超声温度为63℃、超声时间为34min，并按修正后条件进行3次平行试验，测得其提取率平均值为15.03mg/g，与该模型的预测值（15.18mg/g）相比的相对误差只有0.99%，说明该回归模型的准确性和可信度较高，验证了该模型的有效性。因此，可以利用响应面法优化芥蓝多酚的提取，这对于芥蓝多酚的提取与开发提供一定的理论依据和新的方向。

3 结论

以芥蓝为原料，考察影响芥蓝多酚的各工艺因素，结合响应面法优化试验所得的芥蓝多酚提取工艺，建立了超声辅助提取芥蓝多酚回归模型：Y=14.97+0.54A-0.43B+0.17C-0.087D-0.035AB+0.19AC-0.045AD+0.35BC-0.17BD-0.17CD-0.55A2-0.38B2-0.39C2-0.51D2。该回归模型准确性和可信度较高，通过检验模型的显著性，可以得到各因素影响芥蓝多酚提取率的顺序如下：液料比>超声温度>超声时间>乙醇浓度。

在单因素试验的基础上，结合响应面法优化得出超声辅助提取芥蓝多酚的最佳条件为：液料比38mL/g、乙醇浓度61%、超声温度63℃、超声时间34min，在此最优工艺条件下进行平行试验测得芥蓝多酚提取率的平均值为15.03mg/g，模型的预测值（15.18mg/g），两者相比其相对误差为0.99%。表明该模型可以准确可靠地用于预测和分析芥蓝多酚的提取，也为芥蓝多酚的试验研究和资源开发提供了参考依据。

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（责编：张宏民）