改变中心碳代谢途径对发酵生产L-亮氨酸的影响

陈 宁 ，孙鹏杰，李澜潇，张玉富，徐庆阳

(1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津 300457)

随着L–亮氨酸市场需求的增加，微生物发酵法因其经济性和环境友好性成为生产L–亮氨酸的主要方法．最常见的用于生产L–亮氨酸的细菌是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)[1-2]．C. glutamicum是一种从土壤分离的需氧非致病性革兰氏阳性细菌，由于一般公认的安全状态(generally recognized as safe，GRAS)和代谢能力，广泛应用于氨基酸生产行业，特别是用于L–谷氨酸、L–赖氨酸和支链氨基酸(BCAAs)的生产[3]. 在早期，大多数L–亮氨酸生产菌株是通过随机诱变和选择分离出来的．然而，这种方法既费时又费力，而且常常会引起基因组中不必要的改变[4]．目前，代谢工程基因改造已逐渐取代传统的随机诱变筛选的方法成为主流．已有研究者报道了基于代谢工程成功获得L–亮氨酸生产菌的案例[5-12]．

L–亮氨酸的生物合成途径在C. glutamicum中是复杂且受到严格调控的．谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸合成途径如图1所示．由于3个BCAAs的生物合成途径部分地共享相同的基因和酶[13]，糖酵解途径(EMP)的最终产物丙酮酸是BCAAs的中心前体物.ilvBN编码的乙酰羟基酸合成酶(AHAS)，也称为乙酰乳酸合成酶，能催化丙酮酸与另一分子丙酮酸反应生成2–乙酰乳酸或催化丙酮酸与2–酮丁酸生成2–乙酰–2–羟基丁酸，分别对应L–缬氨酸合成途径、L–异亮氨酸合成途径[14]．此外，α–异丙基苹果酸合成酶(IPMS)作为L–亮氨酸生物合成途径的限速酶，受到L–亮氨酸反馈抑制和转录弱化，能催化α–酮异戊酸和乙酰辅酶A(AcCoA)转化为α–异丙基苹果酸[4]. 分析L–亮氨酸合成途径可知，产生1分子L–亮氨酸需要1.5分子葡萄糖，其中1分子葡萄糖可以产生2分子丙酮酸、另外0.5分子用于生产1分子AcCoA[4].

图1 谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸合成途径 Fig. 1 BCAAs biosynthesis pathway of C. glutamicum

AcCoA是许多工业发酵产品的关键前体物，研究者往往通过增加其供应量促进其生物转化为不同产品[15]．C. glutamicum细胞质中合成AcCoA的天然途径是丙酮酸脱氢酶(PDH)旁路[16]．近年来，利用磷酸转酮酶(phosphoketolases，PKTs)和碳重排循环而设计的合成途径，每分子果糖–6–磷酸能生成3分子AcCoA，成功地实现了糖代谢中的碳守恒，而通过EMP途径每分子葡萄糖生成2分子AcCoA[17]. 目前，这个循环称为非氧化糖酵解(non-oxidative glycolysis，NOG)，用于提高AcCoA相关产物的产量，如乙酸酯、丙酮、聚羟基丁酸酯、甲戊酸酯和L–谷氨 酸[18-25]．PKTs可催化木酮糖–5–磷酸/果糖–6–磷酸不可逆裂解为乙酰–磷酸(Ac-P)和甘油醛–3–磷酸或赤藓糖–4–磷酸[21]．Ac-P转化为AcCoA可能有两种途径，一是通过磷酸转乙酰酶(Pta)或乙酸激酶(Ack)，二是通过乙酰辅酶A合成酶(Acs)[26]．除了增加前体物AcCoA的供应，L–亮氨酸生产菌亦需要减少其不必要的消耗．AcCoA进入TCA途径被氧化生成CO2和能量[27]是AcCoA被消耗的主要方式．将编码柠檬酸合酶(CS)的gltA基因前面的两个天然启动子替换为较弱的启动子dapA-L1[5]，CS的活性降低16%，以提高AcCoA生产L–亮氨酸的代谢流．

生产效率的提高是经济性的工业发酵生产过程的关键限制因素[28]．本研究在L–亮氨酸生产菌C. glutamicumCP中引入了一种来源于Bifidobacterium adolescentis的高活性突变体PKT[29]，旨在提高L–亮氨酸生产效率．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

L–亮氨酸生产菌C. glutamicumCP(CGMCC 11425)，克隆宿主Escherichia coliDH5α，质粒pK18mobsacB、pXMJ19、pXT01(pXMJ19ΔlacI)均由天津科技大学代谢工程研究室保藏．本文构建的质粒与菌株见表1．

表1 质粒与菌株 Tab. 1 Plasmids and strains

1.1.2 培养基

Luria-Bertani培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10．

Brain Heart Infusion培养基：3.85%脑心浸液肉汤培养基．

发酵培养基(g/L)：玉米浆10，葡萄糖25，酵母粉5，豆饼水解液20，硫酸铵10，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1，硫酸亚铁1，硫酸锰1，L-甲硫氨酸0.6，L-异亮氨酸0.2．

1.2 方法

1.2.1 质粒与工程菌构建方法

PCR扩增引物通过诺唯赞CE Design引物软件设计，由金唯智公司合成，引物序列见表2．常规的分子克隆方法如PCR、DNA限制性内切按照标准程序进行[30]．C. glutamicum的基因改造方法参考文献[5]．来源于青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的高活性突变体PKT，其编码基因为fxpk，GenBank：MN081868.1，由金唯智公司合成．敲除及基因整合质粒通过重叠PCR获得基因片段，以pK18-ΔltbR∷Ptuf-fxpk为例，分别扩增基因ltbR上下游同源臂、tuf启动子、fxpk和rrnB终止子，与线性化载体pK18mobsacB连接，验证正确后，电转至C. glutamicumCP，经过两次同源重组，获得工程菌．

表2 引物 Tab. 2 Primers

1.2.2 工程菌的培养方法

摇瓶发酵与补料分批发酵方法参考文献[7]．摇瓶发酵：将活化的菌种，以10%接种量接种至30mL发酵培养基中，200r/min、32℃振荡培养．通过指示剂苯酚红确定补加氨水和葡萄糖的时机和体积．补料分批发酵：培养种子液至菌体浓度A600为20～25，以20%接种量接种至3L发酵培养基中，温度为32℃，通过调整转速和通风比使得溶解氧(DO)为20%～30%，pH为7.0，使用泡敌消除泡沫．当培养基中葡萄糖质量浓度低于5g/L时，补充葡萄糖，维持葡萄糖质量浓度为5～10g/L．

1.2.3 分析方法

通过分光光度计测定600nm下的吸光度，以确定C. glutamicum的菌体浓度．采用SBA-40C型生物传感仪测定发酵液中的葡萄糖含量．产物L–亮氨酸及副产物杂酸经过衍生化处理后，通过高效液相色谱(HPLC)进行测定[31]．L–亮氨酸与L–丙氨酸标准曲线如图2所示，在一定浓度范围，二者浓度与峰面积线性关系良好．

图2 L–亮氨酸与L–丙氨酸标准曲线 Fig. 2 Standard curve of L-leucine and L-alanine

1.2.4 统计方法

使用SPSS 18.0(IBM公司)对获得的数据进行统计分析．所有数据均为3个重复的平均值．使用Student’s t-test比较不同处理的发酵性能差异，P＜0.05的差异被认为具有统计学意义．

2 结果与讨论

2.1 PKT的过表达对生产L–亮氨酸的影响

基因过表达的方式有组成型表达和诱导型表达两种．分别以质粒pXMJ19、pXT01为PKT的诱导型和组成型表达载体，构建重组质粒pXMJ-fxpk、pXTfxpk，转化E. coliDH5α．阳性转化子通过菌落PCR验证，结果如图3(a)所示，并进一步通过测序验证. 将测序结果正确的pXMJ-fxpk、pXT-fxpk分别电转至C. glutamicumCP，阳性转化子菌落PCR验证结果如图3(b)所示．将验证正确的转化子培养，抽提质粒，测序验证．经比对测序结果与已知目的基因序列一致，结果表明成功构建PKT过表达的菌株CP01、CP02．

图3 质粒pXMJ-fxpk、pXT-fxpk及菌株CP01、CP02的构建 Fig. 3 Construction of plasmids pXMJ-fxpk and pXTfxpk and strains CP01 and CP02

对出发菌CP、工程菌CP01和CP02进行摇瓶发酵实验，以确定过表达PKT对L–亮氨酸生产菌的影响．3株菌的摇瓶发酵条件相同，其中CP01、CP02使用的培养基添加了相应的抗生素，以避免菌株生长过程质粒丢失．三者摇瓶发酵结果如图4所示(*P＜0.05，**P＜0.01)，发酵48h，菌株CP、CP01、CP02的L–亮氨酸产量分别为21.3、16.9、18.4g/L．与野生型菌株CP相比，过表达PKT，L–亮氨酸的产量略有下降．导入诱导型表达质粒的工程菌CP01生长状态与菌株CP基本无差异，导入组成型表达质粒的工程菌CP02则生长显著下降．工程菌在发酵结束时，副产物L–丙氨酸显著降低，菌株CP、CP01、CP02的L–丙氨酸产量分别为5.6、5.4、4.1g/L．基于PKT的NOG系统能使菌株摄入的葡萄糖不必经过EMP途径生成AcCoA，而由葡萄糖–6-p生成Ac-P进而生成AcCoA，提高了AcCoA的产量，间接减少了前体物丙酮酸的生产，减少了丙酮酸生成副产物的L–丙氨酸的代谢流．

图4 菌株CP、CP01、CP02的摇瓶发酵结果 Fig. 4 Results of flask fermentation of strains CP，CP01 and CP02

2.2 基因组整合PKT对生产L–亮氨酸的影响

当胞内L–亮氨酸浓度高时，转录调节因子LtbR可以抑制leuCD和leuB的表达[32]．事实上，研究者在开发L–亮氨酸生产菌时均选择缺失ltbR基因[5,9]. PKT的整合位点选取ltbR．此外，为了减少AcCoA的消耗，将CS的自然启动子替换为弱启动子dapA. 重组质粒pK18-ΔltbR、pK18-ΔltbR∷Ptuf-fxpk、pK18-ΔPgltA∷PdapA的菌落PCR鉴定结果如图5(a—c)所示．经过测序，进一步确定质粒是否构建成功．将重组质粒pK18-ΔltbR电转化至C. glutamicumCP，经过两次同源重组，得到工程菌CP03．将重组质粒pK18-ΔltbR∷Ptuf-fxpk电转化至CP03，经过两次同源重组，得到工程菌CP04．将重组质粒pK18-ΔPgltA∷PdapA电转化至CP04，经过两次同源重组，得到工程菌CP05，菌落PCR鉴定结果如图5(d—f)所示．经过测序比对，分别与已知序列一致，即得到的工程菌CP03、CP04、CP05构建成功．

图5 重组质粒与菌株CP03、CP04、CP05构建 Fig. 5 Construction of plasmid and strains CP03，CP04 and CP05

对工程菌CP03、CP04、CP05进行摇瓶发酵，结果如图6所示．

图6 菌株CP03、CP04、CP05的摇瓶发酵结果 Fig. 6 Results of flask fermentation of strains CP03，CP04 and CP05

与工程菌CP03、CP04相比，CS启动子替换为弱启动子后，菌体生物量有一定程度下降，分别为51.1、44.7、41.0．由于PKT的导入C. glutamicumCP基因组，使得工程菌生成AcCoA的能力提升，进而提高了以AcCoA为前体物的L–亮氨酸的生成，菌株CP03、CP04、CP05的L–亮氨酸产量分别为21.8、23.4、25.2g/L．此外，NOG系统的引入，分流了一些碳代谢通量，AcCoA的生成减少了对EMP途径的依赖，EMP的终产物丙氨酸相应减少，使得副产物L–丙氨酸的生成减少．菌株CP03、CP04、CP05的L–丙氨酸产量分别为5.3、3.6、3.5g/L．

2.3 补料分批发酵

在5L发酵罐水平培养出发菌C. glutamicumCP和工程菌C. glutamicumCP05生产L–亮氨酸，发酵周期为44h，结果如图7所示(*P＜0.05，**P＜0.01)．

图7 发酵过程曲线 Fig. 7 Fermentation process curve

整个发酵过程，工程菌CP05的生物量低于出发菌CP，培养至稳定期，二者的吸光度分别为165.3、176.1．在发酵前期，工程菌CP05的L–亮氨酸积累低于出发菌，是因为生物量低于出发菌，随着发酵持续进行，由于碳代谢流的分布不同，工程菌生产L–亮氨酸的量逐渐高于出发菌，L–亮氨酸的产量分别为53.0、48.2g/L，二者存在显著性差异(P＜0.05)．工程菌代谢过程中节省了碳骨架，使L–亮氨酸糖酸转化率获得提升，为23.5%，副产物L–丙氨酸的质量浓度为6.4g/L，较出发菌下降33.3%(图8)．

图8 发酵液产物HPLC分析 Fig. 8 HPLC analysis of fermentation broth

3 结 论

通过在L–亮氨酸生产菌内，以游离表达和基因整合两种方式表达高活性的突变体PKT，同时采用“进、通、截、堵、出”的策略[33]对相关基因进行代谢工程改造，获得工程菌株C. glutamicumCP05，经过补料分批发酵验证，能达到提高L–亮氨酸产量和糖酸转化率，降低副产物生成量的目的．基于PKT的NOG系统引入对以AcCoA为前提物的发酵产品具有重要作用．