米邦塔仙人掌两种化学成分鉴定及定量分析

金唯一，李壮壮，吴嘉朔，张方晴，康维钧，石 钺*

（1. 中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2. 河北医科大学 公共卫生学院，河北 石家庄 050017）

米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta）原产于墨西哥，1997年引入我国，现已在我国广泛种植并形成一定规模[1]，2012年国家将其批准为普通食品。米邦塔仙人掌叶片含多糖[2-3]、蛋白质、氨基酸[4]、有机酸、矿物质及少量黄酮和多酚类成分[5]，具有一定的抗氧化、免疫调节、降糖、神经保护等活性[6-7]。此外有文献报道在米邦塔仙人掌中分离鉴定了20余种化合物，多为有机酸类化合物[8-9]，但目前没有相关成分定量分析的报道。本研究从米邦塔仙人掌中分离鉴定了两种化合物，分别为5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸（piscidic acid），其中番石榴酸首次在米邦塔仙人掌中分离得到；并应用高效液相色谱（HPLC）建立了同时检测两种化合物的定量方法，以期为米邦塔仙人掌的开发和利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱（北京迪马科技有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Bruker Avance III 600 MHz核磁共振波谱仪[布鲁克（北京）科技有限公司]；Ultimate 3000超高效液相色谱仪串联Thermo Q-ExactiveTMPlus OrbitrapTM高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×10 mm，1.8 μm）色谱柱（Waters中国有限公司）。

1.2 试药

新鲜米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta），米邦塔仙人掌果购自上海金欣仙人掌专业种植基地；乙腈（色谱纯，Honeywell Burdick & Jackson公司）；甲酸[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；5-羟甲基-2-呋喃甲醛，番石榴酸（自制）。

2 方法与结果

2.1 样品提取与分离

取新鲜米邦塔仙人掌叶片和果实，手工去皮，将叶肉、叶片表皮、果皮分别于60 ℃烘干，打粉，密封后保存在干燥器中，果肉榨汁，经8层纱布过滤后，12 000 r/min离心10 min，除去残渣，果汁保存在-80 ℃ 冰箱中。称取叶片表皮、叶肉、果皮干燥粉各100 g，按料液比1:10，分别用水、70 %乙醇、50 %乙醇加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤除去残渣后，减压回收溶剂，分别得到400，500，400 mg/ml样品储备液。取50 ml叶肉提取液，经制备液相色谱，以乙腈-0.1 %甲酸-水进行梯度洗脱，得到化合物1（67.1 mg）和2（73.6 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：黄色针晶，C6H6O3，ESI-MSm/z：127.04 [M+H]+。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.53（1H，s，CHO），7.38（1H，d，J=3.6 Hz），6.58（1H，d，J=3.6 Hz），4.57（2H，s，H-α）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：179.4（CHO），163.2（C-5），153.9（C-2），124.8（C-3），110.9（C-4），57.6（C-α）。结合以上光谱数据和文献报道[8]，推断该化合物为5-羟甲基-2-呋喃甲醛。

化合物2：类黄色固体粉末，C11H12O7，HESIMSm/z：255.05 [M-H]-。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：4.50（1H，S，H-2），2.99（1H，d，J=13.8 Hz，H-4α），3.14（1H，d，J=13.8 Hz，H-4β），7.08（2H，d，J=8.4 Hz，H-2’，6’），6.66（2H，d，J=8.4 Hz，H-3’，5’）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：173.3（C-1），74.1（C-2），80.1（C-3），40.6（C-4），174.6（C-5），126.6（C-1’），131.1（C-2’，6’），114.3（C-3’，5’），155.8（C-3’）。结合以上光谱数据和文献报道[10]，推断该化合物为番石榴酸。

图1 5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸结构

2.3 对照品溶液的制备

精密称取5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸，用50 %甲醇溶解，配制浓度为10 mg/ml的储备液，备用。

2.4 供试品溶液的制备

取2.1项下的样品储备液，用纯净水稀释至适宜浓度后，12 000 r/min离心5 min，取上清，果汁离心后，取上清，经HPLC分析。

2.5 色谱条件

流动相：流动相A：乙腈，流动相B：0.1 %甲酸水溶液；Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；进样体积10 μl；柱温：30 ℃；梯度洗脱条件为0～25 min，98 %B；25～25.1 min，98 %～95 %B；25.1～35 min，95 %～90 %B；35～35.1 min，90 %～50 %B；35.1～45 min，50 %B；45～50 min，50 %～10 %B；50～60 min，10 %B。流速：1 ml/min；检测波长：275 nm。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性 将适宜浓度的对照样品溶液和供试样品溶液分别注入液相色谱仪，按2.5项下色谱条件测定。对照品溶液和供试样品溶液色谱图分别见图2。供试品溶液的色谱图与对照品溶液的色谱图有相同保留时间的色谱峰，且其他成分无干扰。

图2 专属性考察结果

2.6.2 线性关系、检测限和定量限 取2.3项下对照品溶液，按2.5项下色谱条件进样测定，进行线性回归，计算相关系数。检测限和定量限分别在信噪比为3和10时测定，结果见表1。结果表明，5-羟甲基-2-呋喃甲醛在5～150 μg/ml范围内线性范围良好，R2=0.9992，检测限和定量限分别为0.64 μg/ml和2.31 μg/ml；番石榴酸在10～1200 μg/ml范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9997，检测限和定量限分别为1.51 μg/ml和5.05 μg/ml。

表1 米邦塔仙人掌中两种成分的线性方程、相关系数、检测限和定量限（n=3）

2.6.3 精密度试验 取60 μg/ml对照品溶液，按2.5项下色谱条件重复进样6次，测定两种化合物的峰面积，以峰面积的相对标准偏差（RSD）评价精密度，结果显示5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的峰面积RSD分别为0.90 %和0.45 %，均小于3 %，表明该方法精密度良好。

2.6.4 重复性试验 按2.4项下方法，各部位分别平行制备6份供试品溶液，按2.5项下色谱条件测定，以各峰面积RSD评价重复性，结果显示5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸峰面积RSD分别为2.10 %和1.52 %，均小于3 %，表明该方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 取重复性样品1份，分别于0，6，12，24，48，72 h进样分析，测定各峰面积RSD值，结果显示5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的峰面积RSD分别为0.26 %和0.17 %，均小于3 %，表明待测样品稳定性良好。

2.6.6 加样回收试验 分别取已知含量的样品，分别加入高、中、低3个浓度水平的对照品溶液，每个水平平行制备3份，按2.5项下色谱条件进样测定，计算样品加标回收率，结果见表2、表3，结果显示各样品的加标回收率在90 %～110 %之间，RSD均小于3 %，表明该方法准确度较好。

表2 5-羟甲基-2-呋喃甲醛加样回收试验结果（n=3）

表3 番石榴酸加样回收试验结果（n=3）

2.7 样品分析

将2.4项下适宜浓度的样品，按2.5项下色谱条件，测定各样品中5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量，平行测定3份样品，结果见表4。

表4 米邦塔仙人掌各部位5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量（n=3）

3 讨论与结论

本研究对提取溶剂水、30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇和100 %乙醇的提取效果进行考察，结果叶肉粗提物、叶片表皮粗提物和果皮粗提物分别由70 %乙醇、水、50 %乙醇提取，样品活性较好且待测成分含量较多。对超声提取和加热回流提取两种方法进行考察，两种方法提取率相差不大，但考虑到需大量提取样品，因此选择加热回流提取。

分别对甲醇-水、乙腈-0.1 %甲酸水、甲醇-0.1 %甲酸水3个系统流动相进行考察，结果发现采用乙腈-0.1 %甲酸水作为流动相时，各峰分离度较好，基线平稳，因此采用乙腈-0.1 %甲酸水作为系统流动相。对两种定量成分对照品溶液分别进行UV全波长（190～400 nm）扫描，发现5-羟甲基-2-呋喃甲醛在280 nm处有最大吸收，番石榴酸在220 nm和275 nm处有两个吸收峰，其在220 nm处有最大吸收，但考虑到本实验所测样品番石榴酸含量高于5-羟甲基-2-呋喃甲醛，且在275 nm处各峰的分离度较好，基线平稳，因此本实验选择275 nm作为检测波长。

综上，本实验通过半制备液相色谱仪，分离纯化了两种化合物，分别为5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸，番石榴酸首次在米邦塔仙人掌中被鉴定。本研究采用HPLC同时测定米邦塔仙人掌中5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸含量，方法稳定可靠，方法学考察结果表明精密度、稳定性、重复性和准确度均符合要求，能准确测定米邦塔仙人掌中5-羟甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量，可为米邦塔仙人掌的开发利用和质量控制提供依据。