基于HPLC和多元统计分析的清热解毒口服液质量评价模式研究

朱伟堃，井改革，赵蕊蕊，王素香，赵丹彤

（1. 菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000；2. 山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355）

清热解毒口服液属清热解毒类中成药，收载于《中国药典》2020年版一部，由石膏、金银花、玄参、地黄、黄芩、栀子、连翘等十二味中药组成[1]。具清热解毒之功效，用于热毒壅盛所致的发热面赤、烦躁口渴、咽喉肿痛；流感、上呼吸道感染见上述证候者。清热解毒口服液生产厂家众多，据统计，目前全国有211家生产企业。

清热解毒口服液成分较多，单一指标难以对其进行质量控制，故本文选取了清热解毒口服液中主要起抑菌[2]、清热解毒[3-5]作用的4种成分绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷为指标进行测定和分析。目前，对于4种成分的含量测定虽有报道[6-9]，但均未进行系统的信息处理分析，无法综合系统地评价各生产企业样品的质量。因此，本文采用高效液相色谱法（HPLC）建立了同时测定清热解毒口服液4种成分含量的方法，并采用雷达图分析，结合聚类分析和主成分分析对11家企业的37批次样品进行评价和分类，为清热解毒口服液的质量评价提供了思路和科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 II高效液相色谱仪（安捷伦）；XS105型十万分之一电子天平（Mettler Toledo）；超纯水仪（默克密理博）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号：110753-202018，含量：96.1 %），栀子苷对照品（批号：110749-201919，含量：97.1 %），连翘苷对照品（批号：110821-201816，含量：95.1 %），黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量95.4 %，中国食品药品检定研究院）；甲醇（色谱纯，默克公司），磷酸（色谱纯，国药集团）；清热解毒口服液样品来自2020年山东省内市场流通抽样，具体样品收集情况见表1。

表1 样品收集情况

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温：30 ℃。以甲醇（A）-0.1 %磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（0～20 min，10 %A→25 %A，90 %B→75 %B；20～40 min，25 %A→50 %A，75 %B→50 %B；40～55 min，50 %A，50 %B；55～60 min，50 %A→10 %A，50 %B→90 %B；60～70 min，10 %A，90 %B）。流速1.0 ml/min，进样量：10 μl。检测波长326 nm（0～25 min，测定绿原酸），238 nm（25～35 min，测定栀子苷），230 nm（35～45 min，测定连翘苷），276 nm（45～70 min，测定黄芩苷）。

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称取绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷对照品10.88，10.42，10.38，12.15 mg，分别置25，25，25，50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。分别精密量取上述对照品贮备溶液1.00，1.00，1.00，4.00 ml，置同一10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得分别含绿原酸41.82 μg/ml、栀子苷40.47 μg/ml、连翘苷39.49 μg/ml、黄芩苷92.73 μg/ml的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品1.00 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 专属性考察

2.4.1 阴性样品溶液的制备 按工艺方法制备缺少金银花、栀子、连翘和黄芩的阴性样品，并按2.3项下方法，制得阴性样品溶液。

2.4.2 专属性试验 分别精密吸取2.2项下的混合对照品溶液，2.4.1项下的缺金银花、栀子、连翘和黄芩的阴性样品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果见图1。阴性样品图谱中，未呈现与绿原酸、栀子苷、连翘苷和黄芩苷保留时间相同的色谱峰，表明制剂中处方的其他药味及辅料对检测结果无干扰，该方法专属性良好。

图1 专属性色谱图

2.5 线性关系考察

分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液3，5，10，12，15 μl，依次注入高效液相色谱仪，按2.1项色谱条件进样测定，记录色谱图。分别以绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷的进样量（μg）为横坐标，各峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。结果表明，4种成分在一定范围内均有较好的线性关系。

表2 各成分的标准曲线方程、相关系数、线性范围及检测限、定量限

2.6 检测限和定量限

将2.2项下的混合对照品溶液逐级稀释，以信噪比（S/N）为10时的相应浓度为定量限，各成分定量限见表2；以信噪比（S/N）为3时的相应浓度为检测限，各成分检测限见表2。

2.7 精密度试验

分别精密吸取2.2项下混合对照品溶液10 μl，按2.1项下色谱条件连续进样6次，结果绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.23 %，0.27 %，0.53 %，0.59 %，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液10 μl，室温下放置，按2.1项下色谱条件，分别在0，2，8，12，24 h进样测定，测得供试品溶液中绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷4个成分峰面积的RSD分别为0.34 %，0.26 %，1.33 %，0.13 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性试验

取同一批清热解毒口服液样品（批号：20200306），平行量取6份，每份分别精密量取1.00 ml，按2.3项下方法制得供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，并计算待测成分的含量。结果绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷的含量平均值分别为0.559，1.595，0.204，2.436 mg/ml，RSD依次为0.29 %，0.31 %，1.85 %，0.22 %，表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收试验

取2.8项下已知待测成分含量的清热解毒口服液（批号：20200306）0.50 ml，共6份，分别置25 ml量瓶中，分别依次精密加入2.2项下绿原酸、栀子苷、连翘苷和黄芩苷对照品贮备溶液0.50，2.00，0.30，5.00 ml。按2.3项下方法操作，制备加样回收样品溶液。按2.1项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收试验结果

2.11 样品测定

精密量取各生产企业的清热解毒口服液1.00 ml，按2.3项下方法制得供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，依照2.6项下回归方程计算各成分的含量，含量分布直方图见图2。由图2可见，各成分含量跨度较大，且4种成分的含量分布趋势均有所不同。同时，按《中国药典》2020年版一部含量测定项下黄芩苷的含量测定方法，测定了37批次样品中黄芩苷的含量。并将新建立的方法和药典方法测得的黄芩苷含量，用SPSS Statistics 19.0进行了统计分析，结果P=0.379＞0.05，说明两种方法的测定结果差异无统计学意义，进一步说明建立的方法准确、可行。

图2 样品含量频率分布直方图

2.12 多元统计分析

为进一步综合系统分析清热解毒口服液的质量，本研究分别采用雷达图分析、聚类图分析和主成分分析对11家企业共37批次样品进行分析。

2.12.1 雷达图分析 以绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷含量为质量评价因子，采用Excel 2003版软件绘制37批次清热解毒口服液样品的雷达图，通过比较其轮廓大小及各成分分布情况来反映不同企业样品的质量差异[10]，结果见图3。结果显示，B、H、J、N、P企业样品中4种成分的轮廓较大且分布平衡度较好，提示其样品质量较好；E、G、I、K、O企业样品中4种成分分布平衡度较差；A企业样品中4种成分的轮廓较小，提示样品质量有所欠缺。

图3 雷达分析图

2.12.2 聚类分析 以绿原酸、栀子苷、连翘苷、黄芩苷4种成分的含量为变量，采用SPSS Statistics 19.0软件，选用组间连接法，以Euclidean距离平方为测度，对37批清热解毒口服液样品进行聚类分析，聚类结果见图4。企业聚类结果显示，样品聚为两大类，J、H、B、P、N企业为一类，I、G、E、O、K、A企业为一类。观察各批次样品4种成分含量可发现，J、H、B、P、N企业样品4种成分含量普遍较高，说明整体质量相对较好。

图4 聚类分析树状图

以上述提取的1个主成分因子变量绘制得分图，见图5。11家企业的37批次样品可归为两组，其中I、G、E、O、K、A企业为一组，J、H、B、P、N为一组，其中后一组得分较高，提示其整体质量相对较好。主成分分析结果与聚类分析结果、雷达图分析结果相互印证，进一步说明聚类的分类结果和雷达图分析结果可靠。

图5 样品主成分得分散点图

3 讨论

3.1 试验条件的选择

3.1.1 测定指标的选择 考虑到清热解毒口服液组成处方较多、成分复杂，多指标测定更利于控制其质量，选定绿原酸、木犀草苷、木犀草素、栀子苷、连翘苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素作为质控指标，但在实际测定时发现，该方法对于木犀草苷和木犀草素的专属性不强，且阴性模拟样品中有保留时间相同的色谱杂峰干扰，黄芩素和汉黄芩素含量过低，结果不易判定。故最后选定了该测定方法下专属性较强且制剂中含量较高的绿原酸、栀子苷、连翘苷和黄芩苷作为定量控制的指标。

3.1.2 波长的选择 上述选定的4种成分紫外吸收不同，在同一波长下难以获得理想的灵敏度，故采用DAD采集了4种待测成分在200～400 nm波长范围内的紫外吸收图谱，结合液相色谱图，将波长设定为0～25 min 时326 nm（测定绿原酸）、25～35 min 时238 nm（测定栀子苷）、35～45 min 时230 nm（测定连翘苷）、45～70 min 时276 nm（测定黄芩苷）。

3.1.3 流动相的考察 曾考察了乙腈-水、甲醇-水等不同流动相系统，等度洗脱，结果样品目标峰不易分离，导致仪器重复性较差。查阅文献[11]发现水相中加入一定比例的酸可提高待测成分与邻近杂峰的分离度，且可改善峰形，经过进一步考察，确定采用甲醇-0.1 %磷酸溶液作为流动相系统，梯度洗脱，可获得理想的色谱图。

3.2 质量评价模式

本研究采用HPLC建立了清热解毒口服液中4种主要成分的含量测定方法，并基于多元统计对不同企业样品进行了综合分析和分类，发现不同企业样品质量差异较大。结果显示，雷达图分析结果、聚类分析结果与主成分分析结果一致，I、G、E、O、K、A企业为一类，其样品质量有所欠缺；J、H、B、P、N企业为一类，其样品整体质量相对较好。

4 结论

本研究基于HPLC和多元统计建立了不同企业清热解毒口服液的质量评价模式，可高效、准确地对测定不同生产企业的样品并对其质量进行评估分类。主成分分析发现，绿原酸、栀子苷、连翘苷和黄芩苷含量的高低对清热解毒口服液质量影响均较大，提示对于清热解毒口服液的质量评价不可仅局限于单一指标，应采用多指标进行质量的综合评估。综上，本研究建立的清热解毒口服液HPLC含量测定，基于雷达图分析法、聚类分析法和主成分分析法，可对不同企业清热解毒口服液的质量进行全面系统的评价和分类。