红豆越橘酵素发酵工艺优化及其抗氧化性能研究

綦 菲，孙 妍，王 静，孙银玲，王伟明

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036）

红豆越橘为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）常绿小灌木的浆果，又名红果、红豆[1]。主产自我国黑龙江省大兴安岭地区，具有很高的营养价值。红豆越橘果实中富含有机酸、多种维生素、微量元素及黄酮、原花青素、超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分[2]。红豆越橘果实中已检出24种氨基酸，28种酚类化合物[3]。研究发现，红豆越橘具有抗氧化、抗菌消炎、抗糖尿病、改善心脑血管疾病等功效[4-5]。红豆越橘的价值也逐渐受到人们广泛关注，但由于深度开发力度不够，仅停留在产品粗加工阶段，大多是红豆越橘原浆、浓缩汁等形式。

酵素是以蔬菜、水果、菌类等为原料，经过微生物发酵而制成的，富含多种维生素、矿物质、生物酶等生物活性物质的食品[6-7]。酵素具有抗氧化、抗肿瘤、调节机体免疫力及维持菌群平衡等功能[8]。植物酵素在发酵过程中实现了物质转化，不仅保留了原有果实中的固有营养物质，还产生了新的活性成分。本文对红豆越橘酵素的发酵工艺进行研究，并对其SOD酶活力及清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基活性进行测定，为红豆越橘酵素的应用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Lambda 365紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer）；DHP-9272恒温培养箱，电热恒温水浴锅（上海一恒）；LDZM-80KCS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安）；电子分析天平（赛多利斯）；LG10-2.4A高速离心机（北京京立）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2 试药

红豆越橘采收自黑龙江省伊春市，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为杜鹃花科越橘属植物（Vaccinium vitis-idaeaL.）的果实；DPPH（上海阿拉丁）；SOD测试盒（南京建成生物工程研究所）；维生素C（VC），甲醇，冰醋酸（分析纯，国药集团）；白砂糖为市售；蒸馏水为实验室自制。

2 方法

2.1 红豆越橘酵素的制备

挑选成熟、无霉变的红豆越橘果实，除去树叶、杂质，用无菌水洗去泥沙，匀浆，分别称取50 g红豆越橘置于无菌密封罐中，按比例加入无菌水及白砂糖，恒温下发酵，每隔2 d放气一次，发酵终止后过滤，于紫外灯下照射2 h终止发酵。

2.2 单因素试验

2.2.1 发酵温度的确定 称取红豆越橘50 g，白砂糖10 g，料液比1:2，按红豆越橘酵素的制备方法，分别在15，20，25，30，35 ℃恒温发酵20 d，发酵终止后，测定其SOD酶活力，每个样品重复3次。

2.2.2 料液比的确定 称取红豆越橘50 g，白砂糖10 g，25 ℃恒温，分别按料液比2:1，1:1，1:2，1:3，1:4加入无菌水，按红豆越橘酵素的制备方法，发酵20 d，发酵终止后，测定其SOD酶活力，每个样品重复3次。

2.2.3 白砂糖用量的确定 称取红豆越橘50 g， 25 ℃恒温，料液比1:2，按红豆越橘酵素的制备方法，分别加入6，8，10，12，14 g白砂糖，发酵20 d，发酵终止后，测定其SOD酶活力，每个样品重复3次。

2.2.4 发酵时间的确定 称取红豆越橘50 g，白砂糖10 g，料液比1:2，25 ℃恒温，按红豆越橘酵素的制备方法，分别发酵10，15，20，25，30 d，发酵终止后，测定其SOD酶活力，每个样品重复3次。

2.3 正交试验

通过单因素试验，确定以发酵温度、料液比、白砂糖用量及发酵时间为考察因素（见表1），选用L9(34)正交表进行试验，测定SOD酶活力。挑选20名对色泽、气味、滋味及组织形态都比较敏感的人员，按表2感官评价指标要求进行评分（满分100分），求取平均值。根据综合评分筛选最佳发酵条件。综合评分=感官评分×0.5+SOD酶活力×0.5。

表1 因素水平表

表2 感官评价指标

2.4 红豆越橘酵素清除DPPH自由基能力的测定[9-11]

2.4.1 DPPH工作液的配制 精密称取39.4 mg DPPH于100 ml量瓶，甲醇溶解，定容，4 ℃下避光保存，即得DPPH储备液。实验前移取DPPH储备液15 ml，甲醇定容至100 ml，制成0.15 mmol/L DPPH工作液。

2.4.2 VC对照品溶液的配制 精密称取VC10.0 mg，蒸馏水溶解，定容至10 ml量瓶，即得VC对照品溶液。测定前，分别移取20，40，60，80 μl VC对照品溶液，稀释至10 ml，测定其吸光度。

2.4.3 红豆越橘酵素样品溶液的制备 精密吸取红豆越橘酵素原液200 μl，用蒸馏水定容至10 ml，即得红豆越橘酵素稀释液。再分别吸取400，500，600，700，800 μl稀释液，定容至10 ml，即得红豆越橘酵素样品溶液。

2.4.4 红豆越橘酵素清除DPPH自由基能力的测定在试管中加入0.15 mmol/L的DPPH工作液3.2 ml，再加入红豆越橘酵素样品溶液0.8 ml，混匀后，25 ℃避光反应30 min，517 nm波长处测定吸光度，以VC作为阳性对照[12-13]。按下式计算DPPH自由基的清除率（%）。

式中A0为DPPH溶液和蒸馏水混合液的吸光度；A1为DPPH溶液和红豆越橘酵素样品溶液混合液的吸光度。

2.5 红豆越橘酵素SOD酶活力的测定

将红豆越橘酵素液4000 r/min离心10 min，吸取上清，按SOD酶试剂盒说明书测定SOD酶活力。

2.6 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件分析处理相关数据。

3 结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 发酵温度对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

结果见图1。由图1可见，在15～30 ℃之间，红豆越橘酵素的SOD酶活力随温度的升高显著增长，温度达35 ℃时，呈骤然下降趋势，分析可能是温度过高影响酶的活性。

图1 发酵温度对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

3.1.2 料液比对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

结果见图2。由图2可见，随料液比增加，SOD酶活力值呈上升趋势，当料液比达1:2时，SOD酶活力达最高值，之后呈缓慢下降趋势，分析可能是达最佳料液比后，随料液比增加，酵素浓度下降。

图2 料液比对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

3.1.3 白砂糖用量对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

结果见图3。由图3可见，随白砂糖用量的增加，红豆越橘酵素的SOD酶活力呈显著上升趋势，当白砂糖用量达10 g时，SOD酶活力值最高，随后呈缓慢下降趋势。

图3 白砂糖用量对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

3.1.4 发酵时间对红豆越橘酵素SOD酶活力的影响

结果见图4。由图4可见，随发酵时间的增加，红豆越橘酵素SOD酶活力值显著增加，发酵时间在25～30 d时，SOD酶活力基本趋于平稳。

图4 发酵时间对红豆越橘酵素的影响

3.2 正交试验结果

正交试验及方差分析结果见表3、表4。由表3、表4可见，4个因素对红豆越橘酵素影响次序为C（白砂糖用量）＞A（发酵温度）＞D（发酵时间）＞B（料液比），其中白砂糖用量对试验结果有显著影响（P＜0.05），发酵温度、料液比、发酵时间对实验结果无显著影响。根据直观分析结果，确定最佳工艺条件为A2B1C1D2，即红豆越橘50 g，发酵温度30 ℃，料液比1:1（g/ml），白砂糖用量8 g，发酵时间20 d。

表3 正交试验结果与分析

表4 方差分析

3.3 红豆越橘酵素清除DPPH自由基能力测定结果

红豆越橘酵素与VC对照品溶液对DPPH自由基的清除能力测定结果见图5、图6。以DPPH自由基清除率为纵坐标，以红豆越橘酵素稀释液及VC对照品溶液体积为横坐标做图，得红豆越橘酵素清除DPPH自由基线性方程：Y=0.0828X-0.18，R2=0.9971；VC清除DPPH自由基线性方程：Y=1.1695X+14.5，酵素清除DPPH自由基线性方程：Y=0.0828X-0.18，R2=0.9976。由方程可知，当清除率为50 %时，606 μl红豆越橘酵素稀释液与30 μl 1 mg/ml VC溶液的抗氧化能力相当。

图5 VC对DPPH自由基的清除能力

图6 红豆越橘酵素对DPPH自由基的清除能力

3.4 红豆越橘酵素SOD酶活力测定结果

红豆越橘发酵前SOD酶活力为1488 U/ml，按最佳工艺条件发酵后，SOD酶活力为3624 U/ml。

4 结论

本研究以红豆越橘果实为原料，在不添加菌种的条件下，对红豆越橘进行了自然发酵，通过单因素考察及正交试验分析，以感官评价及SOD酶活力综合评分为考察指标，得出最佳发酵条件：红豆越橘50 g，发酵温度30 ℃，料液比1:1，白砂糖用量8 g，发酵时间20 d。通过DPPH自由基清除能力及SOD酶活力测定，对红豆越橘酵素的抗氧化活性进行了初步研究，发酵后红豆越橘酵素SOD酶活力显著提高，说明发酵过程能更好地促进SOD的形成。结果表明，红豆越橘酵素具有较好的抗氧化性能。