食用香料香兰素衍生化产物XY201713的抗菌活性及细胞毒性评价*

陆 静， 林奇泗

(1 徐州医科大学第一临床医学院, 江苏 徐州 221004;2 徐州医科大学药学院， 江苏 徐州 221004)

近年来，食用香料及其修饰产物在抑菌方面的应用日益受到重视[1-2]。香兰素(Vanillin)，又名香草醛，为一种广泛使用的可食用香料，可在香荚兰的种子中找到，也可以人工合成[3]。香兰素对一些细菌和真菌有不同程度的抑制作用，且具有浓烈奶香气息[4-5]。当前香兰素被广泛运用在各种需要增加奶香气息的调香食品中，如蛋糕、冷饮、巧克力、糖果；还可用于香皂、牙膏、香水、橡胶、塑料、医药品。此类食用香料的应用对减少抗生素滥用和遏制细菌耐药性有较为积极的作用[6]。

然而香兰素在抗菌方面有一定的不足，如钟少枢等在对比七种单离食用香料的抑菌活性时发现，香兰素的抗菌谱较窄，且对大肠杆菌的抑制活性较差[7]。基于香兰素的结构特性可通过化学手段将一些活性基团引入香兰素或其衍生物中进行结构改造，开发的新型抗菌剂具有更低的抑菌浓度，更好的抑菌效果。如以香兰素为原料合成香豆酮和香兰素衍生物新型席夫碱具有更强的抑菌效果[8-10]。本课题组对香兰素羟肟酸为原型进行了计算机模拟设计，合成了一种新型化合物XY201713(图1)。本研究对该化合物进行抗菌活性和细胞毒性评估，为进一步开发新型食品防腐剂提供研究基础。

图1 XY201713的分子结构图

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

HH-2数显恒温水浴锅，浙江省嘉兴市俊思仪器设备厂；AL104电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；SW-CJ-ZD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；DPX-650型电热恒温培养箱，沈阳市医疗器械二厂；VarioskanLUX型全自动酶标仪，美国ThermoScientific公司。

1.2 材料与试剂

蛋白胨、琼脂、牛肉膏，购自北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠、葡萄糖，购自天津市大茂化学试剂厂；卡那霉素(批号：130344-201904)，中国药品生物制品检定所；氟康唑(批号：100345-201903)，中国药品生物制品检定所；无菌水，徐州医学院药学院实验室自制(临用前灭菌处理)；RPMI.1640不完全培养基，江苏省凯基生物技术股份有限公司；无血清细胞冻存液，微科曼得生物工程有限公司；药品XY201713为实验室自制；乙醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜均为分析纯。

1.3 供试菌种和细胞

大肠埃希氏菌(ATCC8739)，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，米曲霉(ATCC42149)和臭曲霉(ATCC14916)由中科院微生物研究所提供。细菌菌株在37 ℃下Luria-Bertani(LB)培养琼脂中培养24 h，真菌在28 ℃下Czapek营养琼脂中培养48 h。

巨噬细胞系RAW264.7，由中科院上海细胞库提供。

2 实验方法

2.1 抗菌活性试验

2.1.1 溶液的制备

取药品XY201713适量，用2%二甲基亚砜(DMSO)溶解定容至最终浓度约为3.0 mg/mL，并用0.45 μm微孔过滤器滤过，作为供试品溶液，临用前稀释。

阴性对照溶液为2%DMSO水溶液。

精密称定卡那霉素、氟康唑对照品适量，分别加无菌水制成浓度为1.01 mg/mL和1.20 mg/mL的阳性对照品溶液。

2.1.2 抑菌活性的测定

通过圆盘扩散法进行抑菌活性研究。用打孔机将吸水力强的滤纸制成直径为6 mm圆片，经高压灭菌后，逐片定量加入供试品溶液、阳性对照溶液和阴性对照溶液各10 μL备用。

取灭菌后的Luria-Bertani(LB)培养琼脂20 mL，加入0.2 mL菌悬液，倒入平皿，分别制成金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌培养平板；量取灭菌后的Czapek营养琼脂20 mL，加入0.2 mL菌悬液，分别制成米曲霉和臭曲霉的真菌培养平板。将含有供试品溶液、阴性对照和阳性对照溶液的滤纸片分别加入细菌和真菌培养平板表面，每个菌种平行3皿，放入培养箱中，其中，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌平板在37 ℃下培养24 h；米曲霉和臭曲霉的真菌平板在28 ℃下培养48 h。培养结束后，取出观察有无抑菌圈，并测定抑菌圈直径，mm。

2.1.3 最低抑菌浓度(MIC)测定

取2.1.1项下供试品溶液、阴性对照溶液和阳性对照溶液分别用二倍稀释法稀释为一系列不同浓度的提取液后，依次添加到2 mL各种供试菌的菌悬液中。分别取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液10 μL铺涂至Luria-Bertani(LB)培养琼脂中，培养皿在37 ℃培养24 h。取米曲霉和臭曲霉10 μL铺涂至Czapek营养琼脂中，培养皿在28 ℃培养48 h。以没有肉眼可见的细菌或真菌生长时的提取物最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。

2.2 细胞增殖-毒性检测

采用CCK8法进行检测。取对数生长的巨噬细胞RAW264.7进行离心分散后，接种于96孔板中，其中每孔约含有1×104个细胞，周边孔中加入PBS以防止边缘效应。待细胞贴壁后，弃去细胞上清，同步化处理12 h，周边孔中仍加入PBS。然后，加入一系列浓度梯度的供试品溶液(0、10、20、30和50 μg/mL)继续培养。其中每种浓度至少设置6复孔，实验重复3次。24 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，于5%CO2，37 ℃恒温培养箱中继续培养4 h，取出立即于450 nm用酶标仪下测定吸光度。

根据下列公式计算细胞存活率：

3 结果与讨论

3.1 抑菌活性结果

XY201713供试品对四种病原菌的抑菌圈大小及最小抑菌浓度见表1。XY201713供试品对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)、米曲霉(真菌)和臭曲霉(真菌)均有良好的的抑制效果。

表1 XY201713的抗菌活性

破折号(-)表示未检测。

a.DD表示在抑菌圈直径，以mm计；b.MIC表示最小抑菌浓度，以mg/mL计。

3.2 细胞增殖-毒性检测结果

为了明确XY201713的毒性作用，检测了不同浓度下PPC对巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响。如图2所示，XY201713对RAW264.7的增殖能力影响不显著，不抑制细胞的增殖(P>0.05)，结果表明：在实验浓度下，XY201713对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性影响不显著。

图2 XY201713对巨噬细胞RAW264.7增殖的影响

4 结 论

本研究初步探究XY201713对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、米曲霉和臭曲霉具有一定抑菌活性。同时在实验浓度下，XY201713对巨噬细胞的细胞毒性影响不显著。这提示我们，XY201713对细胞的安全性较好。

XY201713有一定抑菌活性，同时对细胞的安全性较好，具有一定开发潜力。同时，XY201713的其他方面活性还有待于进一步开发研究。