5-甲酰基尿嘧啶合成工艺研究

詹庆明 席 锐 叶俊文 龙 艳 杨维清

(西华大学 理学院，四川 成都 610041)

在人类的基因组中发现了具有多种修饰作用的嘧啶，其中嘧啶[1]和N6-甲基腺嘌呤(6 mA)起着最主要的修饰作用[2]。由于5-甲酰基嘧啶在DNA遗传学方面有着非常重要的作用，了解其在表观遗传学中的各种信息，可以更加直观的增加对遗传调控甚至疾病治疗方面的理解[3]。5-甲酰基尿嘧啶(5fU)作为DNA中的一种修饰5-甲酰基胞嘧啶的核碱基对应物也开始受到越来越广泛的关注[4-6]。

5-甲酰基尿嘧啶现有的合成方法主要有：(1)5-甲基尿嘧啶与过硫酸钠溶于水中，然后在85～90 ℃下反应9 h，但是该方法会产生大量副产物，导致产物分离较为困难，且该方法得到合格产品的收率较低；(2)由5-羟甲基尿嘧啶氧化羟甲基得到5-甲酰基尿嘧啶，但是该方法对催化剂的要求较高，容易产生副产物5-羧基尿嘧啶，从而降低反应收率。本文采用尿嘧啶为原料，与多聚甲醛反应进行羟甲基化，再与硝酸铈铵进一步反应制备得到5-甲酰基尿嘧啶。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

多聚甲醛，硝酸铈铵，高锰酸钾，二氧化锰，三乙胺，甲醇，无水乙醇，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，均购置于成都科龙试剂公司；尿嘧啶购置于上海麦克林生化科技有限公司。所有试剂未经处理直接使用。去离子水为实验室自制二次水。数据分析采用：核磁共振仪，AVANCE NEO 400，布鲁克(北京)科技有限公司。

1.2 5-羟甲基尿嘧啶的制备

取20 mL去离子水加入到50 mL单口圆底瓶中，加入尿嘧啶(0.56 g, 5 mmol)和多聚甲醛(0.18 g, 6 mmol)，不断搅拌，滴加1 mL三乙胺，缓慢加热到90 ℃，薄层色谱实时监测反应进度(展开剂V二氯甲烷∶V甲醇=10∶1)，原料尿嘧啶反应完全后，减压浓缩至5 mL，再加入15 mL 95%乙醇，室温下静止30 min，再在4 ℃下静置4 h，过滤出沉淀，再用5×15 mL 95%乙醇洗涤5次，收集固体沉淀。60 ℃下烘干，得到目标产物5-羟甲基尿嘧啶(化合物2)(图1)。白色固体0.65 g，产率91%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) 11.05 (s, 1H), 10.71 (s, 1H), 7.24(s, 1H),4.85 (t,J=5.5 Hz, 1H), 4.11 (dd,J= 5.5, 1.1 Hz, 2H)。

图1 5-羟甲基尿嘧啶的制备Fig. 1 Preparation of 5-hydroxymethyluracil

1.3 5-甲酰基尿嘧啶的制备

将化合物2(0.3 g, 2 mmol)加入到15 mL水中，加热至70 ℃搅拌溶解，再加入硝酸铈铵 (2.3 g, 4 mmol)，不断搅拌溶解，溶解完全后加热升温至回流，反应4 h。待溶液变为浅黄色为止。薄层色谱实时监测反应进度(展开剂V二氯甲烷∶V甲醇=10∶1)，反应完全后，冷却至室温，减压浓缩液体至剩余约5 mL，此时已有白色固体析出，然后在2～4 ℃下冷藏过夜，抽滤出固体，并用3×10 mL丙酮洗涤沉淀3次，干燥得到固体产品如图2所示。白色粉末0.23 g，产率83%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ11.92 (s, 1H), 11.52 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 8.14 (s, 1H)。

图2 5-甲酰基尿嘧啶的制备Fig. 2 Preparation of 5-formyluracil

2 结果与讨论

本文首先采用羟甲基化反应，在尿嘧啶的5位引入一个羟甲基得到中间化合物5-羟甲基尿嘧啶，然后根据制备得到的5-羟甲基尿嘧啶继续反应来制备5-甲酰基尿嘧啶。对后一个反应(图2所示)考查了反应时间、溶剂、温度、催化剂等四类条件。

首先以水作为溶剂，70 ℃下反应2 h，考察不同氧化剂存在下的反应效果。实验结果表明：在相同反应溶剂、反应时间、反应温度的条件下，高锰酸钾和二氧化锰作氧化剂时，都没有明显发现生成目标化合物；而硝酸铈铵作为氧化剂时，有目标产物的生成，收率可以达到38%。可能的原因是高锰酸钾和二氧化锰的氧化性太强，将羟甲基氧化成了羧基，因此没有发现目标产物。

然后以水作为溶剂，硝酸铈铵(CAN)作为氧化剂，考察不同反应温度、反应时间条件下的反应效果。实验结果表明：在相同溶剂和氧化剂的条件下，时间相同时，温度由70 ℃升高到90 ℃，目标化合物的产率由41%增加到74%；相同温度的条件下(90 ℃)，反应时间由2 h增加到4 h，目标化合物的产率由74%增加到79%。可能是因为随着时间的增加，催化剂的有效作用时间增加，因此产率会增加；而温度的升高会增加氧化剂的活性，催化效果更好，产率增加。

最后以硝酸铈铵(CAN)作为氧化剂，回流条件下反应4 h，考察不同反应溶剂的反应效果。实验结果表明：分别以水、甲醇、乙醇作为溶剂，在常压回流条件下反应，收率分别为83%、19%、22%。然而，在相同时间(4 h)、温度(100 ℃)和氧化剂(CAN)的条件下，H2O、DMF、DMSO反应效果都较好(收率分别为83%、77%、81%)，可能是因为这三种溶剂对反应底物溶解性较好的原因。但由于H2O、DMF、DMSO反应效果差别不是特别显著，考虑环保、经济性等因素，最终我们选择以H2O作为反应溶剂。

3 结论

本文研究开发了一种新的合成5-甲酰基尿嘧啶的方法：以尿嘧啶为起始原料，在三乙胺为碱的条件下，与多聚甲醛反应制备得到中间化合物5-羟甲基尿嘧啶，收率可以达到91%；再以该中间体为底物进行氧化反应，制备得到5-甲酰基尿嘧啶，在最优条件下该反应收率可以达到83%。重点考察了氧化反应步骤中，氧化剂、反应时间、反应温度对产物收率的影响。在最优反应条件下，以尿嘧啶为起始原料，两步反应总收率可以达到75%以上。该方法操作简单易实施，反应条件温和，收率高。本文研究获得了5-甲酰基尿嘧啶的合成新工艺，该工艺原料易得，反应条件温和，收率高。并对目标产物采用核磁共振进行了结构表征。