高效液相色谱法测定土壤中草甘膦的残留

郑亚丽 冯小康 朱 强

(苏州国环环境检测有限公司，江苏 苏州 215000)

草甘膦(glyphosate)，又名农达，是世界上应用最多的一种高效、广谱、低毒的水溶性除草剂，广泛应用于茶园、果园、甘蔗园等系列农作物的种植中[1-4]。其在农作物中的作用机理主要是通过抑制植物体内5-烯醇丙酮莽草酸-3-膦酸盐合成酶的活性，干扰植物体内莽草酸的合成[5]。该合成酶存在于芳香族氨基酸生物合成中，而且只有在绿色植物中才能产生，因此草甘膦对绿色植物除草效果明显。随着草甘膦使用量的不断增加，其残留量严重破坏生态平衡。多项研究表明，土壤中的草甘膦及其代谢产物氨甲基膦酸能够通过代谢作用进入植物体内污染环境，并通过食物链进行富集传递，影响人类食品安全[6]。因此，对土壤中草甘膦的残留状况进行监测十分重要，研究建立可靠且能在普通实验室推广使用的检测方法尤为关键。

目前，国内外草甘膦的检测方法主要有气相色谱法[7]，高效液相色谱法[8]，离子色谱法[9-10]，气相色谱—质谱法[11-13]，液相色谱—质谱法[14-15]等。因草甘膦具有易溶于水，难溶于有机溶剂，挥发性低，结构中缺少发色团和荧光团等特点，常规方法很难直接检测[16]。为满足普通实验室对土壤中草甘膦的残留检测，高效液相色谱是最适合的分析方法。同时结合9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-CL)柱前衍生技术，以液液萃取净化土壤中和衍生化产生的杂质，用具荧光检测器的液相色谱进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器设备及试剂

Agilent LC 1260，具荧光检测器 (美国 Agilent 公司)；色谱柱为Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×4.6 mm，4 μm，美国Agilent公司)；Milli-pore纯水处理装置(美国Millipore公司)；DT55高速离心机(北京时代北利离心机有限公司)； ME204电子天平(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)；KQ-600V 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；THZ-82混匀仪(金坛市科析仪器有限公司)，以及一般实验室常用仪器和设备。

草甘膦标准品(1 000 mg/L，上海安谱实验科技股份有限公司)；磷酸(分析纯，无锡市晶科化工有限公司)；盐酸(优级纯，昆山金城试剂有限公司)；十水合四硼酸钠(优级纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；9-芴甲基氯甲酸酯(优级纯，Toronto Research Chemicals)；十二水合磷酸钠(99.99%，阿拉丁)；二水合柠檬酸三钠(ACS级，上海安谱实验科技股份有限公司)；乙腈、二氯甲烷、正己烷(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)。

1.2 标准曲线的绘制

取一定量的草甘膦标准品，纯水定容并配制成10.0、20.0、50.0、100、200、500 μg/L系列混合标准溶液，按1.3.2步骤进行衍生化实验后，从低浓度到高浓度依次进样分析。以标准系列溶液中目标化合物浓度为横坐标，以其对应峰面积为纵坐标建立标准曲线，外标法定量。

1.3 样品的制备

1.3.1 样品提取

称取10 g土壤空白样品至50 mL离心管中，加入50.0 mL磷酸钠和柠檬酸钠混合提取液，超声提取30 min，8 000 r/min离心5 min，上清液用滤纸过滤，得到提取液。提取液用盐酸溶液调节pH值至9，静置10 min后用滤纸过滤，加入50 mL正己烷，充分振荡后静置，弃去有机相，水相用50 mL正己烷再萃取一次。

1.3.2 衍生化

取1.00 mL上述净化后的水溶液于试管中，加入0.12 mL四硼酸钠溶液和0.20 ml 9-芴甲基氯甲酸酯溶液，密封。常温下用混匀仪衍生4 h，用针式过滤器过滤后待测。

1.4 仪器分析条件

色谱柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18 (150 mm×4.6 mm，4 μm)；流动相：A(乙腈)，B(0.2%磷酸水溶液)，梯度洗脱程序如表1所示；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：30 μL；荧光条件：激发波长254 nm，发射波长315 nm。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

2.1.1 色谱柱的选择

色谱柱的质量直接影响到样品组分的分离情况、组分的定性及定量分析。实验比较了Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱，ZORBAY ODS柱和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱3种液相色谱柱对草甘膦衍生物的分离效果。实验结果显示，草甘膦衍生物在ZORBAY ODS柱和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱上分离效果差，响应值低，且峰型较宽，有拖尾；而在Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱子上分离效果最好，且峰形尖锐对称，色谱图见图1。

图1 不同色谱柱条件下草甘膦衍生物的高效液相色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives under different column conditions(A) ZORBAY ODS柱；(B) ZORBAX Eclipse XDB-C18柱；(C) Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱

2.1.2 波长的选择

不同物质在特定波长下的吸收强度不同，吸收强的响应值就高，反之，响应值小。为了使草甘膦衍生物响应值最高，本实验分别比较了草甘膦衍生物在波长301 nm和315 nm条件下的响应情况，结果如图2所示。草甘膦衍生物在波长315 nm条件下峰形良好，响应值很高。故，选择315 nm作为本实验发射波长。

图2 不同波长条件下草甘膦衍生物的高效液相色谱图Fig. 2 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives at different wavelengths(A) 301 nm；(B) 315 nm

2.1.3 流速的选择

流动相的流速对目标物质的分离具有一定的影响。分析了流速为0.5 mL/min和1.0 mL/min时草甘膦衍生物的响应情况，结果显示在该色谱条件下，流速增大会使草甘膦衍生物峰型变宽，响应强度降低，因此，本实验选择0.5 mL/min作为实际分析流量。

图3 不同流速条件下草甘膦衍生物的高效液相色谱图Fig. 3 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives at different flow rates(A) 0.5 mL/min；(B) 1.0 mL/min

2.2 衍生时间的优化

选取1 mL 0.50 mg/L经前处理的草甘膦标准溶液进行试验，常温条件下按照1.3.2条件分别衍生0.5 h、2 h、4 h、6 h和8 h。观察在相同的实验条件和检测条件下，不同衍生时间对应的样品测定含量的变化。结果如图 4 所示，当衍生时间为4 h时，草甘膦衍生物含量最大。因此，衍生时间选择4 h。

图4 反应时间对衍生反应的影响Fig. 4 Effects of reaction time onderivatization reaction

2.3 标准曲线和检出限

按照上述测定草甘膦衍生物的最优条件，配制不同质量浓度的草甘膦标准溶液(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L)，以标准系列溶液中目标化合物浓度为横坐标，以其对应峰面积为纵坐标，建立标准曲线。结果(图5)表明，草甘膦在0.01～0.50 mg/L范围内线性关系良好，线性方程为y=1.05x+0.381，R2= 0.999 9。

图5 草甘膦衍生物标准曲线Fig. 5 Standard curve ofglyphosate derivatives

按照样品分析的全部步骤，对加标含量为0.05 μg/g 的样品进行10次平行测定，根据10次平行测定的标准偏差计算检出限。

MDL=t(n-1,0.99)×S

式中：MDL——方法检出限；n——样品的平行测定次数；t——自由度为n-1，置信度为99%时的t分布(单侧)；当n=10时，根据t值表查得t(n-1,0.99)=2.821;S——n次平行测定的标准偏差。

计算得出检出限为0.01 mg/kg。

2.4 准确度和精密度

准确称取10 g土壤空白样品，分别添加0.100、0.500和1.00 mg/kg的草甘膦标准溶液，在选定的最佳检测条件下测定加标回收率及相对标准偏差(RSD)，每个浓度重复6次。空白样品的制备除了不加标，其它步骤同上。结果如表2所示。

表2 不同添加水平下的平均回收率和相对标准偏差Tab. 2 Average recovery and relative standard deviation at different addition levels

3 结束语

本文通过对浓度为0.100、0.500和1.00 mg/kg的土壤加标样品进行6次重复测定，得出草甘膦的加标回收率为80.0%～100%；样品间的相对标准偏差为5.3%～7.8%，检出限0.01 mg/kg，低于方法标准规定检出限(0.02 mg/kg)。该方法实用性强，重现性好，精密度和准确度高，检出限低，非常适用于土壤、地下水、地表水、生活污水、工业废水中草甘膦的检测。