Cd、Pb复合胁迫对狼尾草种子萌发及幼苗生长的影响

国伟强，杜 雪，彭玉兰，李源恒，赵春莉，曲同宝

(吉林农业大学园艺学院，长春 130118)

由于大气沉降、采矿冶炼以及污水灌溉等影响，对土壤生态环境和人类健康构成严重威胁[1-3]。调查结果显示，2014年中国土壤重金属总超标率高达16.1%，其中镉(Cd)、铝(Pb)分别占7.0%和1.5%，已成为我国城市地表土壤中含量超标最多的两种重金属[4]。Cd、Pb生态毒性较大易形成复合污染，对生态环境造成不可估量的伤害[5-6]。因此，如何高效、经济地治理土壤Cd、Pb污染，已成为急需解决的环境问题。

应用植物修复重金属污染的土壤是一种行之有效的方法，具有经济成本低、操作简单易行等优点，可通过植物提取、固定和降解等方式减少土壤中的有毒有害物质[7-8]。我国拥有丰富的禾草资源，大量试验研究表明，禾本科植物适应性强，根茎发达，生长快速，地下须根相互延伸交错，更有利于吸收土壤中的重金属[9-10]。目前研究方向多集中于重金属胁迫对结缕草(Zoysiajaponica)、黑麦草(Loliumperenne)、早熟禾(Poaannua)等草坪草的影响[10-11]，而其他园林常用禾草资源在耐重金属胁迫方面有待进一步开发利用。

狼尾草(Pennisetumalopecuroides)是禾本科(Poaceae)狼尾草属(Pennisetum)多年生草本植物，具有生长迅速、生物量大、根系发达、抗逆性强、管理粗放等优点，被称为“能源草”，得到广泛应用[13-14]。目前，对狼尾草的研究主要集中在耐盐抗旱性、水土保持、园林应用等方面[15-17]，而有关重金属对狼尾草的影响研究相对较少，仅限于狼尾草与其他植物对重金属耐性的比较[13,18-19]，而Cd、Pb胁迫对狼尾草种子萌发及幼苗生长等方面的研究未见报道。因此，本研究以狼尾草为材料，设置不同浓度Cd、Pb单一胁迫及复合胁迫试验，探讨Cd、Pb胁迫对狼尾草种子萌发及幼苗生长的影响，以期为废弃尾矿和垃圾填埋场等Cd、Pb污染地区选择耐性植物材料应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

狼尾草种子购买于花卉市场，千粒重为4.19 g。重金属Cd、Pb分别以CdCl2和Pb(CH3COO)2水溶液的形式添加。

1.2 方 法

试验在吉林农业大学园艺学院实验室进行，依据国家土壤环境质量标准(GB 36600—2018)并结合预试验所得结果设置Cd、Pb处理浓度，其中Cd浓度设置为A1=0,A2=20 mg·L-1,A3=40 mg·L-1,A4=80 mg·L-1;Pb浓度设置为B1=0,B2=250 mg·L-1,B3=500 mg·L-1,B4=1 000 mg·L-1(表1)。

表1 Cd和Pb复合处理组合设计Table 1 Combination design of composite treatment with Cd and Pb

将狼尾草种子用浓度为1%的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒10 min，用去离子水反复冲洗，除去漂浮的劣质种子后用滤纸吸干种子表面水分备用。将经高压灭菌后的玻璃培养皿(直径9 cm)放置两层定性滤纸作为狼尾草种子的发芽床，每床整齐放入50粒种子，每个处理3次重复。每个培养皿用移液枪缓慢加入5 mL不同浓度的重金属溶液，并以蒸馏水为对照处理。将培养皿置于智能型人工气候培养箱，设置培养参数为25±1 ℃、湿度70%、光照强度3 500 lx，光照14 h/黑暗10 h。为保持滤纸湿润，每天采用称重法补水。

1.3 测定指标及方法

1.3.1发芽指标测定

发芽指标测定参照QU等[20]的方法，每天同一时间观察并记录种子发芽情况，以胚根露白后突破种皮2 mm为种子萌发标志，参试种子连续3 d不发芽视为发芽结束。

1.3.2形态学指标测定

狼尾草种子发芽结束后，从培养皿中随机取出10株狼尾草幼苗测定根长、芽长。

1.3.3生理指标测定

发芽试验结束后参照张治安等[21]的方法测定相关生理指标，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光还原法；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法。

1.4 数据处理

试验数据用Excel 2010软件和SPSS 19.0软件进行统计分析，显著性水平为p<0.05。采用Origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 Cd、Pb胁迫对狼尾草种子萌发的影响

由图1可知，Cd单一胁迫浓度为20 mg·L-1时，可轻微促进狼尾草种子的萌发，而当Cd胁迫浓度为80 mg·L-1时，狼尾草种子的发芽率和发芽指数与对照相比分别显著降低13.08%和11.02%(p<0.05)。在Pb单一胁迫下，狼尾草种子发芽率和发芽指数随着Pb浓度的增加逐渐降低，Pb胁迫浓度为1 000 mg·L-1时，发芽率和发芽指数最低，分别为63.33%和18.12，较对照分别降低26.93%和22.01%。Cd、Pb复合胁迫显著抑制狼尾草种子的萌发(p<0.05)，发芽率和发芽指数较对照分别降低3.85%～41.54%和3.23%～68.23%，在复合重金属胁迫浓度为Cd 80 mg·L-1+Pb 1 000 mg·L-1时二者均达到最低值。

注：Cd浓度范围内不同铅浓度水平之间的显著差异用小写字母(a～d)表示；Pb浓度范围内不同镉浓度水平之间的显著差异用大写字母(A～D)表示，(p<0.05)。下同。图1 Cd、Pb对狼尾草发芽率和发芽指数的影响Fig.1 Effects of Cd and Pb on germination rate and germination index of P. alopecuroides.

2.2 Cd、Pb胁迫对狼尾草幼苗生长的影响

由图2可知，重金属Cd、Pb胁迫显著抑制狼尾草幼苗根和芽的生长，Cd、Pb单一胁迫下狼尾草幼苗根长较对照分别降低3.91%～63.04%和27.57%～79.37%，芽长分别降低25.74%～49.53%和5.87%～40.87%，其中Cd浓度为20 mg·L-1时，狼尾草的芽长高出对照4.54 mm，差异未达显著水平(p>0.05)。Cd、Pb复合胁迫下狼尾草幼苗根长、芽长较对照显著降低了29.08%～89.62%和13.23%～75.40%(p<0.05)。复合胁迫的抑制作用大于单一胁迫，且无论单一胁迫还是复合胁迫对根生长的抑制效果均明显大于芽长。

图2 Cd、Pb对狼尾草幼苗根长和芽长的影响Fig.2 Effects of Cd and Pb on root and bud length of P. alopecuroides seedlings

2.3 Cd、Pb胁迫对狼尾草幼苗可溶性蛋白含量和MDA含量的影响

由图3可以看出，Cd、Pb单一胁迫下狼尾草幼苗可溶性蛋白含量随着胁迫浓度的增加呈先升高后降低的变化趋势，在Cd浓度为20 mg·L-1、Pb浓度为500 mg·L-1时可溶性蛋白含量达到最高，分别为3.34 mg·g-1和5.28 mg·g-1，较对照显著增加了33.07%和110.36%(p<0.05)。Cd、Pb复合胁迫下狼尾草幼苗可溶性蛋白含量逐渐降低，当复合胁迫处理为A2+B2时可溶性蛋白含量最高(3.73 mg·g-1)，较对照高出48.61%；当复合胁迫处理为A4+B4时达到最低(0.92 mg·g-1)，比对照减少63.35%。

图3 Cd、Pb对狼尾草幼苗可溶性蛋白含量和MDA含量的影响Fig.3 Effects of Cd and Pb on soluble protein content and MDA content of P. alopecuroides seedlings

狼尾草幼苗MDA含量随着Cd、Pb浓度的增加显著升高。在Cd浓度为80 mg·L-1、Pb浓度为1 000 mg·L-1时达到最大值，为0.30 μmol·g-1和0.35 μmol·g-1，较对照分别显著增加了50.57%和77.57%(p<0.05)。当Cd、Pb复合胁迫处理为A4+B4时，MDA含量达到峰值(0.45 μmol·g-1)，为对照的2.25倍。复合胁迫对狼尾草幼苗MDA含量的促进作用高于单一胁迫。

2.4 Cd、Pb胁迫对狼尾草幼苗SOD和POD活性的影响

由图4可知，Cd、Pb单一胁迫下狼尾草幼苗SOD活性随着胁迫浓度的增加先升高后降低，在Cd浓度为20 mg·L-1、Pb浓度为250 mg·L-1时达到最大值，较对照分别显著增加37.56%和25.87%(p<0.05)；在Cd浓度为80 mg·L-1、Pb浓度为500 mg·L-1时达到最小值，较对照分别降低7.45%和13.06%。Cd、Pb复合胁迫下狼尾草幼苗SOD活性随着胁迫浓度的增加显著降低(p<0.05)，在复合胁迫处理为A2+B2时，SOD活性达到峰值(473.20 U·g-1)，较对照增加了51.80%。当复合胁迫处理为A4+B4时，SOD活性达到最小值(145.30 U·g-1)，较对照降低了53.39%。

图4 Cd、Pb对狼尾草幼苗SOD活性和POD活性的影响Fig.4 Effects of Cd and Pb on SOD activity and POD activity of P. alopecuroides seedlings

Cd单一胁迫下狼尾草幼苗POD活性随着胁迫浓度的增加逐渐升高，在Cd浓度为80 mg·L-1时达到最大值，较对照显著增加9.02%(p<0.05)。Pb单一胁迫下POD活性随着胁迫浓度的增加先升高后降低再升高，表现为无规律波动，在Pb浓度为1 000 mg·L-1时达到最大值，较对照增加了8.38%(p<0.05)。在Cd、Pb复合胁迫下狼尾草幼苗POD活性随着胁迫浓度的升高总体呈上升趋势，在胁迫处理为A3+B4时POD活性达到峰值[1 088.04 U·(g·min)-1]，较对照提高了14.52%。

3 讨 论

3.1 Cd、Pb对狼尾草种子萌发及幼苗生长的影响

种子萌发是植物生长的初始时期也是植物暴露于重金属胁迫下的最早阶段，能够在一定程度上反映出植物耐逆境胁迫的能力[9,11,22]。通常认为，重金属胁迫对植物种子萌发可表现出“低促高抑”的效应[10]。在本研究中，狼尾草种子萌发及幼苗对Cd、Pb胁迫的响应不同，在Cd胁迫下表现为低促高抑，在胁迫浓度为20 mg·L-1时可轻微促进狼尾草种子萌发及幼苗的生长，说明其对低浓度Cd表现出一定耐性，但随胁迫浓度的升高，植株中蓄积累量越多，狼尾草种子萌发受阻，对幼苗生长的毒害作用也逐渐增强[22]；在Pb胁迫下表现为持续抑制，这与彭昌琴等[23]、朱红霞等[24]研究有所差异。出现这一现象的原因可能是Pb阻碍了狼尾草种子内部蛋白质和淀粉的合成，从而导致狼尾草种子萌发及幼苗根和芽的伸长受到了抑制[25]，同时也证明了狼尾草种子对重金属耐受性表现为Cd>Pb。此外，Cd、Pb复合胁迫相较于Cd、Pb单一胁迫对狼尾草影响更大，说明Cd与Pb存在协同作用加大对狼尾草的毒害，这与邹文桐等[26]结果一致。在本研究中Cd、Pb单一胁迫与复合胁迫对根伸长的抑制效果均大于芽长，这可能是狼尾草种子胚根突破种皮吸收溶液中重金属，将重金属离子固定在根系细胞壁上，导致根尖细胞有丝分裂速度减慢甚至无法正常分裂，从而抑制其根的伸长[22]，与赵雅曼等[10]研究基本一致。

3.2 Cd、Pb对狼尾草幼苗生理特性的影响

植物体内的可溶性蛋白作为渗透调节物质与重金属离子结合，形成一种重金属结合蛋白，减少游离态重金属离子的含量，从而减轻重金属对植物的损伤[27-28]。在本研究中，Cd、Pb单一胁迫下狼尾草幼苗体内可溶性蛋白的含量先升高后降低，而复合胁迫下狼尾草幼苗体内可溶性蛋白的含量持续降低，这与张家洋[29]的研究结果相似，与郭堤等[30]研究结果不一致，可能是在低浓度Cd、Pb胁迫下狼尾草幼苗为维持细胞正常代谢合成大量可溶性蛋白，当狼尾草体内重金属离子进一步增多或Cd、Pb复合胁迫时，多肽表达受到抑制从而降低了可溶性蛋白含量[27]。

MDA含量通常用于指示植物细胞膜受损的程度，其作为脂质过氧化作用的最终分解产物反映了重金属胁迫下的活性氧水平[31]。在本研究中，狼尾草幼苗MDA含量与Cd、Pb胁迫浓度呈正相关，这与TAUQEER等[32]研究基本一致，可能是细胞内重金属浓度升高时，诱发狼尾草幼苗体内活性氧的链式反应，羟基自由基(-OH)、超氧自由基(-O2-)大量积累对细胞膜造成损伤[33]。另外本研究发现，在相同Cd浓度胁迫下，随着Pb胁迫浓度的升高MDA含量大幅增加，说明Pb胁迫造成的狼尾草幼苗细胞膜损害程度更加严重。

SOD、POD在植物的抗氧化酶系统中起协同作用维持自由基正常代谢，在一定范围内能有效去除体内过量的ROS以减轻重金属对植物的损伤[20,34-35]。在本研究中，随着Cd、Pb胁迫浓度的升高，狼尾草幼苗SOD活性呈先增后减的趋势，在Cd、Pb复合处理为A2+B2时显著激发了SOD潜在活性，当重金属浓度进一步加大时SOD活性显著降低，表明植物仅在一定的重金属浓度范围(Cd ≤ 20 mg·L-1、Pb ≤ 250 mg·L-1)具有抵抗力，这与陈顺钰等[34]、李瑞莉等[36]的研究基本一致。狼尾草幼苗POD活性随着Cd、Pb胁迫浓度的升高总体上呈增加趋势，这与李西等[11]的研究结果不一致，可能是Cd、Pb胁迫浓度的持续增加导致自由基动态平衡紊乱，抗氧化酶系统遭到破坏。

4 结 论

低浓度Cd(≤ 20 mg·L-1)单一胁迫促进狼尾草种子萌发及幼苗生长，高浓度则转为抑制作用，Pb单一胁迫抑制狼尾草种子萌发及幼苗生长，复合胁迫比单一胁迫抑制作用更明显，对狼尾草种子和幼苗造成的伤害更大。高浓度Cd、Pb单一及复合胁迫下，可溶性蛋白含量降低，MDA含量增加，抗氧化酶系统遭到破坏。狼尾草对两种重金属均有一定的耐性，可作为耐性植物材料应用在Cd、Pb污染风险较低地区。