基于ITS基因的部分石斛属序列分析

何婷婷，刘 达，柴军红

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157000)

石斛属 (DendrobiumSw.)是兰科(Orchidaceae)第二大属，全球有1 500～1 600个原生种，中国有74种2变种，主要分布于西南和华南地区[1]，以云南南部为主。 该属包含13个组，其中多个种的新鲜或干燥茎可被用于入药，统称为“石斛”。石斛(D.nobile)作为常用的道地药材，在中成药中具有重要地位，其内含的多种活性成分，如石斛多酚等，具有抗氧化、滋阴清肺，生津止渴，养胃除烦等功效[2]。由于石斛的药用价值不断被挖掘，使得其活性相关研究日益增多。研究发现，石斛的品质除了取决于多糖类[3]和石斛碱类[4]的种类和含量外，还取决于其他类生物碱[5]。此外，石斛也是重要的花卉植物，与卡特兰、蝴蝶兰、万代兰同被誉为“四大名兰”[6]。

ITS基因是细胞核内非编码区基因，包含ITS 1、5.8 s和ITS 2三部分。由于其进化速度快，核苷酸序列具有高度变异性及长度上的保守性，可以提供丰富的变异位点和信息位点[7-8]，所以，近年来在科内、属间及种间的亲缘关系鉴定、系统发育关系及遗传多样性的研究应用较多[9-10]。目前，ITS基因在多物种中作为条形码被应用，但在石斛属中却未有研究报道。

本实验利用Genbank中已有的石斛属植物的ITS序列进行遗传多样性的研究，从分子角度确认种间亲缘关系，可填补国内对于石斛属分子地位研究的空白，也可为药用植物市场上石斛品种的鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料共包括石斛属(DendrobiumSw.)75个种和外类群厚唇兰属(EpigeneiumGagnep)1个种。详情见表1。

1.2 序列来源

所需序列来自于NCBI。登录NCBI，搜索“Dendrobium+ITS”，保存为“.txt”格式。然后利用在线软件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)对序列进行比对，最后根据比对结果删除冗余序列，再次保存。

1.3 数据分析

用ClustalX 1.83软件对FASTA格式文件进行序列对比，并且保存为.aln格式。然后再利用MEGA 4转化为.meg格式，最后利用该格式文件进行遗传距离的计算及系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 石斛种间序列分析

根据核苷酸序列比对结果构建图1和图3。发现75个石斛种中，共有颠换位点1 746个，其中剑叶石斛的颠换位点最多，为53个，分别位于28 bp、82 bp、101 bp、423 bp、538 bp等处，占总比的3%；变异位点最少的为晶帽石斛，为3个，分别出现在17 bp、105 bp、200 bp处,占总比的0.2%。

由图1可以看出，发生T-A的颠换最多，为403个，其中发生颠换位点最多的剑叶石斛，T-A颠换所占比例最高，为3.2%，颠换位点最少的晶帽石斛占总颠换个数的0.4%。发生C-G的颠换最少，为101个，其中剑叶石斛仅发生了1个颠换位点，位于221 bp。

转换位点共出现2 529个，藏南石斛的变异位点数目最多(65个)，占2.6%；黄花石斛的变异位点最少(17个)，分别出现在85 bp、95 bp、166 bp等处，占0.7%。

图2显示，C-T转换位点最多，为869个，占34.4%。其中，藏南石斛发生转换的位点最多，为25个，分布于36 bp、56 bp、62 bp等；喉红石斛最少，为6个。G-A转换最少，为475个，其中小双花石斛最多，占总数的4.8%，兜唇石斛、束花石斛、齿瓣石斛等4种石斛发生G-A转换最少，均为2个。

图2 ITS发生转换位点数量Fig.2 Number of ITS sites occurred transition

2.2 种间遗传距离分析

利用MEGA 4对序列进行分析，结果表明，75个石斛种间遗传距离在0～0.295之间。其中矮石斛与喉红石斛的遗传距离为0，但与其他石斛属植物的遗传距离均较远，在0.076～0.22之间，与藏南石斛的遗传距离最大，为0.22。晶帽石斛和鼓槌石斛的遗传距离为0，但和其他石斛属植物的遗传距离较远，其中与单葶草石斛的遗传距离最远为0.228。球花石斛和密花石斛的遗传距离为0，但与其他石斛属植物差距较大，遗传距离范围在0.088～0.217之间。翅萼石斛与黑毛石斛的遗传距离为0，与其他石斛属植物的遗传距离在0.02～0.22之间波动。少花石斛与海南石斛的遗传距离为0，与其他石斛属植物的遗传距离范围在0.06～0.28之间。草石斛和玫瑰石斛的遗传距离最大，为0.295。

将图3的遗传距离进行统计，并人为分为15个范围，统计每个遗传距离范围内的个数。结果表明，遗传距离在各个范围内呈先升高后降低的趋势，且出现了2个峰值，一个是0.141～0.16范围内，遗传距离个数最多，达469个，占总数的16.5%；其次是0.121～0.14，为445个(15.6%)。个数最少的遗传距离范围是0.281～0.3，为4个(0.1%)(图3)。

图3 遗传距离的分布范围Fig.3 Distribution range of genetic distance

2.3 系统发育树的构建

利用75个石斛种的序列构建出系统发育树，如图4。除圆柱叶组和草叶组基本可以独自成枝外，其他组与组之间的分界不太明显。很多不同组的种在分子鉴定中，聚为一支，说明同源性较高，但形态学中却将其分类在不同的组中。例如：5号钩状石斛、6号重唇石斛均隶属于瘦轴组(形态分类)，但图4中却与石斛组的多个种聚为一支，其中6号重唇石斛和45号石斛间的遗传距离仅为0.002。外类群76号厚唇兰与禾叶组的双花石斛和小双花石斛聚为一支，遗传距离也仅有0.11，说明该外类群没有较好地将不同的属分开，该基因不适用于这两个属的鉴别。

图4 ITS系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequence

3 讨 论

石斛作为重要的中药材，在中医中应用广泛，对于阴伤津亏、食少干呕、目暗不明等症状均有疗效。在道地药材中，石斛主要是指石斛(D.nobile)、铁皮石斛(D.officinale)的茎枝，统称为“石斛”。目前对于石斛的研究多集中在其植株的繁殖[11-12]、活性成分的研究[13]及功能成分的分离鉴定[14]等方面。但由于石斛种类繁多，市面价格昂贵，所以对于石斛不同种的系统地位及其关系的研究就尤为重要，中国植物志中，石斛的系统地位是利用形态特征(比如根茎叶的特点)来进行分类，将石斛属分为不同组，进而确认种与种之间的亲缘关系远近，但该分类标准具有一定的主观性，故本研究利用分子标记辅助选择技术确定石斛的种间亲缘关系，结果与形态结果比较差异性较大，多个组内的不同种混合在一起，不能很好地区分，外类群也与该属植物混为一支，未达到理想的分类目的。推测可能是石斛栽培品种较多，且繁殖以分枝为主，故而导致多个种的起源相同，分析检测中核苷酸的差异性小，同源性高，分类结果不明显。

另一方面，导致本研究结果不理想的原因可能是基因的选择。ITS为细胞核基因，处于核内非转录区，无法编码基因的转录、翻译。随着该基因出现在大众视野以来，迅速占领了分子标记辅助选择技术的核心地位，究其原因，是因为该基因的序列较短，扩增重现性好，成本低。正因如此，越来越多的学者将ITS作为区分属内、属间或种间系统地位和种间亲缘关系的标记之一。目前，该基因已被广泛应用于动植物和微生物的多个研究领域，对于中药材的鉴别，新物种的认定，微生物群体的识别等新兴研究方向提供了便利。在大多数研究中，ITS基因均可很好的区分研究样本，对于研究结果较为模糊的实验，可利用其他标记进行研究。本研究后续会再利用其他基因标记，比如叶绿体基因，线粒体基因等具有一定变异性的标记进行样本间的系统发育关系研究。