应用ISSR 分子标记绘制黔西南州梨品种DNA 的指纹图谱

桂腾琴,李春艳，秦 燕,韦 燕，王颖娟

(1.兴义民族师范学院生物与化学学院，贵州 兴义 562400；2.贵州省民族药用生物资源研究与开发重点实验室，贵州 兴义 562400)

Potter等[1]研究蔷薇科系统发育与分类认为，梨属蔷薇科(Rosaceae)苹果亚族(Malinae)植物。据统计，全世界梨属植物大约有35种，原产于中国的大约有13种[2]。贵州地方梨品种资源丰富，包括砂梨(P.pyrifoliaNakai)、杜梨(P.betulaefoliaBge.)、豆梨(P.calleryanaDcne.)、麻梨(P.serrulataRehd.)等种类，砂梨为主要栽培食用的种质[3]。黔西南部分梨品种的叶形、花色、果型等极为接近，对品种的鉴定存在一定难度。

DNA指纹图谱在品种鉴定等方面有许多优点[4]，如能鉴定品种遗传相似性而且还能鉴定遗传差异等[5-6]。近年来AFLP、ISSR、SRAP等多种新型标记技术广泛地应用于动物、植物中[7-9]。汪斌等[10]运用软件绘制出82个红麻种质资源DNA指纹图谱。李志良等[11]利用ISSR分子标记构建了32个杜鹃花品种DNA指纹图谱。这些研究结果表明，ISSR技术稳定性、重复性比较好，已广泛用于杜鹃、黄麻、红麻、小菊等DNA指纹图谱绘制。关于梨品种分子标记研究主要集中在RAPD分析、SSR分析、AFLP分析等[12-14]，有关黔西南梨品种DNA指纹图谱构建还未见报道，梨品种分子水平的鉴定缺少相应依据。本试验利用ISSR分子标记构建黔西南梨品种DNA指纹图谱，为黔西南地方梨资源有效保护、鉴定、评价利用及遗传多样性研究提供借鉴。

注：M为2 000 bp DNA marker；1～24为梨品种，图中的数字与表1中的品种编号一致。下同。图1 ISSR引物UBC 825在黔西南州24个梨品种中的扩增图谱Fig.1 Amplification of ISSR primer UBC 825 in 24 pear varieties in Qianxinan perfecture

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在贵州省民族药用生物资源研究与开发重点实验室进行。试验所用的24个梨品种(表1)采自黔西南州各县。取幼嫩且无病虫害的叶片，用硅胶干燥后备用。

表1 供试的梨品种Table 1 Information of pear varieties tested

1.2 方 法

1.2.1基因组DNA提取

采用桂腾琴等[15]的方法提取梨基因组DNA，检测DNA的纯度和浓度，将DNA稀释至40 ng·μL-1，于-20 ℃保存备用。

1.2.2ISSR-PCR分析

PCR扩增所用引物、TaqDNA聚合酶、Marker等均购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。参照桂腾琴等[16]PCR反应体系、PCR扩增程序，用1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.3梨品种DNA指纹图谱的绘制

凝胶电泳图上有扩增条带且清晰的标记为“1”，没有条带的标记为“0”。把图片信息转换成数字资料，构建黔西南部分梨品种的数字指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 多态性ISSR引物筛选

以海子梨、雪梨和黄金梨的基因组DNA为模板，筛选出12条多态性高且清晰的引物，再进一步筛选出3条核心引物(UBC 825(AC)8T、UBC 834(AG)8YT和UBC 816(GA)8T)对24个梨品种资源进行ISSR扩增，构建黔西南州优良梨品种的标准指纹图谱。

2.2 多态性引物对供试材料的ISSR分析

黔西南梨品种DNA的ISSR特征数字指纹见表2，从表2可以看出，能将供试梨品种完全区分开有40条谱带。图1、图2为2个引物扩增电泳图，扩增条带比较清晰、多态性丰富，可将不同梨品种区分开。

表2 黔西南州24个梨品种DNA的ISSR特征数字指纹Table 2 ISSR characteristic digital fingerprints of DNA of 24 pear varieties in Qianxinan perfecture

表2(续)

图2 ISSR引物UBC 834在黔西南州24个梨品种中的扩增图谱Fig.2 Amplification of ISSR primer UBC 834 in 24 pear varieties in Qianxinan prefecture

2.3 特征谱带的筛选分析

3条核心引物(UBC 825(AC)8T、UBC 834(AG)8YT和UBC 816(GA)8T)分别能扩增出13、12、15条多态性条带，能将24个品种鉴别开。

3 讨 论

3.1 指纹图谱构建的方法

随着DNA标记检测技术不断完善和发掘，以及品种保护意识的增强，构建了如玫瑰[17]、茄子[18]、草莓[19]、红麻[10]、杜鹃[11]等的DNA指纹图谱。指纹图谱的构建主要有3种方法：一是将引物扩增的电泳图赋值转化为‘0，1’数字串指纹[20-21]；二是从多个引物扩增条带中挑选稳定的特异位点组成‘0，1’数字串指纹[22-23]；三是将二进制的‘0，1’数字串转换成“十进制数字串条形码”，此方法很少有研究者应用[24]。第一种虽然相对简单，但工作量较大且鉴定未知样品相对麻烦；第二种构建图谱比较简单，但是要想获得更多的特异位点来鉴定未知样品，成本高；第三种对数据的观察和比对相对灵活，但条带的统计工作量大且比较麻烦。本研究构建的指纹图谱采用的是程保山等[21]的方法。

3.2 应用ISSR技术构建梨DNA指纹图谱的可行性

目前梨品种DNA指纹图谱构建的研究非常少，仅有张小双等[25]利用17对SSR引物构建了53份秋子梨的分子身份证，且给每份秋子梨建立了条形码标识；冉昆等[26]利用10对SSR引物构建了山东45份地方梨种质资源的分子身份证，分子身份证采用数字和字母结合，将品种的指纹图谱进行数字化，克服了人工比对的低效、繁琐。邵雪花等[27]利用2个ISSR核心引物UBC 809和UBC 886组合，成功构建了28份余甘子品种(系)的DNA指纹图谱；葛亚英等[28]利用4条多态性ISSR引物构建了41个丽穗凤梨品种的分子指纹图谱。邵雪花和葛亚英的研究表明，ISSR标记技术可以较准确地应用于余甘子和丽穗凤梨品种鉴定研究。本研究结果也表明，ISSR标记稳定性高，准确性好，3条核心引物能很好地将黔西南州栽种的24个梨品种鉴别开来，构建的指纹差异丰富且条带清晰，可以选用ISSR标记构建DNA指纹图谱。

3.3 梨DNA指纹图谱绘制的应用价值

黔西南州部分梨品种在形态上极为接近，存在“同名异物”、“异名同物”现象，品种之间表型差异越来越小，单纯依靠叶形、茎色、花色等传统的特征很难将品种的本质差异准确地鉴别开，因此，要想获得鉴定梨品种有效的方法，构建梨品种DNA指纹图谱非常重要。在完善梨品种DNA指纹库时应尽量选择具有代表性的品种，选择的核心引物有一定的标准和数量信息的贮备，对未知品种的鉴定起非常重要的作用[29]。分子标记数据不能替代形态学数据，在研究中若能将形态标记的信息与分子数据有效结合来构建指纹图谱，则可靠性更高，更具有说服力，能快速高效地鉴定梨种质，提高梨种质鉴定和评价的效率。