中性粒细胞在老年小鼠术后认知功能障碍中的作用研究

张芮芮 吴 彤 施郁淼 罗佳美 苏殿三 田 婕

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是指患者在麻醉及手术后出现的认知功能下降，主要表现为注意力无法集中、记忆受损、学习执行和语言理解能力下降[1-3]，是一种常发生于老年患者术后的临床并发症。尽管POCD的病理生理学机制尚不明确，但越来越多的研究认为高龄已经成为POCD重要且独立的危险因素[4-5]。由于人口老龄化逐年加重，接受麻醉手术的老年患者比例也不断攀升。因此，针对老年患者这一特殊群体的POCD 诱因、预防、诊断及治疗的相关研究越来越受到重视。

外周炎症反应可能是POCD发生的重要因素[6-8]。中性粒细胞是外周血中数量最多的炎症细胞[9]，也是参与机体固有免疫应答的重要组成部分，在损伤及炎症早期是调节控制及清除初始损伤刺激物的重要细胞[10]。然而，中性粒细胞在老年小鼠POCD发展中的作用尚不清楚。本研究采用中性粒细胞拮抗剂——粒细胞分化抗原1抗体(anti-granulocyte-differentiation antigen 1, 抗Gr1)清除小鼠体内的中性粒细胞[11]，并通过新物体识别(novel object recognition, NOR)实验[12]检测老年小鼠经过处理后的识别记忆能力的变化，探索中性粒细胞在老年小鼠POCD发生、发展中扮演的角色。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 C57BL/6J小鼠由上海实验动物研究中心提供，18～20月龄，健康雄性，每只体重约30 g。小鼠于上海交通大学医学院附属仁济医院东院麻醉实验室饲养并进行相应实验。首先将小鼠分为对照组(6只)和手术组(5只)，手术组在异氟烷麻醉下制备胫骨骨折复位内固定术模型，对照组不予手术处理。使用流式细胞术检测术后第2天两组小鼠外周血中性粒细胞百分比。另取一批小鼠，用于探讨中性粒细胞对小鼠学习认知功能影响。根据给药和手术情况，随机分为对照组、抗Gr1组、手术组和抗Gr1+手术组，每组8只。其中，对照组和手术组小鼠予腹腔内注射100 μL 0.9%氯化钠(NaCl)溶液；抗Gr1组和抗Gr1+手术组小鼠予腹腔内注射以0.9%NaCl溶液稀释的抗Gr1(6 mg/kg)100 μL，以上各组每天注射1次,共注射4 d。在注射的第2天，手术组和抗Gr1+手术组小鼠进行胫骨骨折复位内固定术。

1.2 胫骨骨折复位内固定术 手术组和抗Gr1+手术组在异氟烷麻醉下行胫骨骨折复位内固定术，具体操作步骤：异氟烷麻醉诱导后，将小鼠固定于保温板上，左后侧胫前皮肤备皮和消毒，沿中线做一长约1 cm的纵行切口，钝性分离并暴露小鼠胫骨，分离骨膜，注意保护肌肉组织。将一根长度为8 mm、直径0.38 mm的针刺入骨髓腔，切断胫骨，然后用针将胫骨复位并固定。术毕，以0.9%NaCl溶液清理伤口，缝合切口，待麻醉30 min后，将小鼠放入干净的鼠笼内，予烤灯照射保温，等待自然苏醒。

1.3 流式细胞术检测中性粒细胞百分比 胫骨骨折复位内固定手术后第2天，将小鼠麻醉后心尖取血；加入红细胞裂解液，室温避光20 min，离心后弃上清液，PBS重悬；加入荧光素标记的小鼠流式抗体(PE-CD45、BV421-CD11b、FITC-Ly6G、APC-Ly6C)，浓度均为1∶100，4 ℃避光孵育30 min后以PBS洗涤、离心、重悬，应用流式细胞分析仪检测CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint细胞群。比较各组小鼠中性粒细胞百分比的差异。

1.4 小鼠行为学测定 为了评估中性粒细胞在老年小鼠POCD中的作用，胫骨骨折复位固定术后第2天，通过NOR实验检测小鼠的物体识别和记忆能力。NOR是一种高效快速测定小鼠学习记忆能力的实验，利用啮齿类动物记住熟悉物体后会花费更多时间探索新物体这一现象设计而成。具体方法：术后第1天将小鼠放到实验房间适应0.5 h，再移至实验用黑色无顶塑料箱(60 cm×50 cm×40 cm)中自由探索5 min，让小鼠适应实验环境。24 h后，箱内提前放入2个相同物体，分别距离箱壁15 cm，两物体间距20 cm；将小鼠贴箱壁放入，放入点距两物体的距离相同；自由探索5 min，然后取出小鼠，让其休息3 h。随后将其中1个物体替换为材质相同、颜色与形状不同的新物体，再将小鼠从原位置放入箱内自由探索5 min。对新、旧物体的探索行为是指小鼠在看向新物体或旧物体时用鼻子嗅其气味或做出用前肢触碰物体这一动作。实验中通过用摄像机记录、回看以精确计算小鼠在箱中探索新、旧两个物体的时间。总探索时间=新物体探索时间+旧物体探索时间，代表了各组小鼠好奇并探索物体的基本能力。识别系数=探索新物体的时间/(探索新物体时间+探索旧物体时间)×100%，代表了小鼠识别和分辨新物体的能力。每只小鼠实验结束后用75%乙醇擦拭箱子，避免前一只小鼠残留的气味和排泄物影响实验结果。

1.5 流式细胞术检测抗Gr1消除中性粒细胞的效果 NOR实验后，4组小鼠麻醉后心尖取血，流式细胞术检测步骤同1.3。

2 结 果

2.1 老年小鼠术后外周中性粒细胞增多 胫骨骨折复位内固定术后第2天，使用流式细胞仪检测老年小鼠对照组和手术组外周血中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint)的比例。比较白细胞内中性粒细胞百分比可以发现，术后第2天老年小鼠外周血中中性粒细胞比例显著升高(57.88%±2.76%比51.15%±1.16%，P<0.01)。见图1。

图1 流式细胞术检测中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint)百分比

2.2 消除中性粒细胞后老年小鼠术后识别记忆能力明显改善 4组小鼠对新、旧物体的总探索时间的差异无统计学意义(P>0.05)，提示小鼠探索物体的能力基本处于同一水平。但对照组、抗Gr1+手术组小鼠在新物体上的探索时间显著长于旧物体(P值分别<0.01、0.05)，即明显表现出对新物体的偏好。而手术组小鼠在新、旧物体上的探索时间的差异无统计学意义(P>0.05)，手术组小鼠的识别系数显著低于对照组(P<0.05)。抗Gr1+手术组小鼠的识别系数与对照组间的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表明手术后老年小鼠的识别记忆能力受到一定程度的损伤。但在用抗Gr1消除中性粒细胞后，接受手术的老年小鼠仍旧表现出对新物体的偏好。以上结果表明，消除体内中性粒细胞可以改善老年小鼠术后的认知能力损伤。

表1 4组老年小鼠外周血中性粒细胞百分比和NOR实验探索时间及识别系数的比较

2.3 抗Gr1明显消除中性粒细胞 连续4 d腹腔内注射抗Gr1后，使用流式细胞仪检测小鼠外周血中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint)的变化情况。从表1可见，与各自对照组相比，使用抗Gr1的两组小鼠外周血中中性粒细胞几乎完全被消除(P值均<0.01)。单纯使用抗Gr1(抗Gr1组)和使用抗体并且进行手术处理(抗Gr1+手术组)小鼠外周血中性粒细胞的消除效果的差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

本研究发现老年小鼠经胫骨骨折复位内固定术处理后第2天，外周血中性粒细胞比例明显增多。NOR实验的结果显示，使用抗Gr1处理老年小鼠，消除其体内的中性粒细胞后，接受手术的老年小鼠对新物体的探索时间延长，识别能力增强，提示中性粒细胞参与到老年小鼠POCD的发生、发展过程中。清除中性粒细胞可以改善老年小鼠的术后认知功能。

近年来，麻醉和手术的安全性有极大提高，但老年患者术后的行为和认知功能仍然备受关注。之前的动物实验结果表明，吸入麻醉剂暴露或者局部麻醉下手术造成的认知功能障碍大多发生在老年而非成年动物，其原因可能为：老年动物的脑血流量减少、神经系统代谢障碍、小胶质细胞活化增加和神经递质功能损害等[13-15]，但具体发生机制尚不明确。其中，手术诱发的外周炎症反应与术后中枢神经系统炎症及认知障碍有关[16]。He等[17]研究发现，麻醉和手术后，老年小鼠外周血中的促炎细胞因子高迁移率族蛋白B1(HMGB1)明显升高，血脑屏障破坏，并出现神经炎症和记忆损伤，伴有POCD发生。

中性粒细胞在对抗机体急性炎症中起重要作用，虽然生理条件下小鼠体内的中性粒细胞生存时间仅12.5 h左右[18]，但在外周炎症时，其可被病原体等多种刺激物激活，表达一系列选择素配体及整合素，与血管内皮细胞黏附，并通过血管内皮细胞之间的间隙渗入组织。中性粒细胞寿命延长并从血液中被趋化至炎症部位，有助于小鼠胫骨骨折复位内固定术后伤口的愈合，促进炎症消退。然而，中性粒细胞就像一把双刃剑，既能对抗病原体，保护受损组织，当其过度浸润和激活时却又可能破坏正常的组织结构，对宿主自身造成严重的损害。例如，在感染性关节炎和阿尔兹海默病等多种人类疾病中扮演重要角色[19-20]。本研究发现，老年小鼠胫骨骨折复位内固定术后第2天外周血中性粒细胞百分比显著升高；消除体内中性粒细胞可明显改善小鼠术后认知功能损伤，提示中性粒细胞也参与了老年小鼠POCD的发生。

在连续4 d使用抗Gr1将小鼠体内中性粒细胞几乎完全清除后，并未观察到小鼠术后感染率或死亡率有所增加。这可能与机体的免疫系统是一个包括了多种先天性及获得性免疫细胞的复杂系统有关。中性粒细胞只是先天性免疫系统中的一部分，在中性粒细胞被消除后，其他先天免疫细胞，如自然杀伤细胞、嗜酸或碱性粒细胞、巨噬细胞等可能发挥了代偿作用，保护实验动物免受感染。

综上所述，本研究认为老年小鼠接受手术后中性粒细胞数量增加，参与POCD的发生、发展。抗Gr1可以清除小鼠体内中性粒细胞，改善其认知功能。然而，中性粒细胞影响术后认知功能的机制并不十分明确，应进一步研究中性粒细胞的滚动、黏附和迁移过程，找到其与中枢的联系“枢纽”。本研究结果可为通过减少中性粒细胞预防POCD的发生提供实验依据。