肿瘤坏死因子α-238基因多态性与儿童热性惊厥的相关性研究

黄玉娟 许 淼 沈 蕾 刘 坚 陈婷婷 张国琴

热性惊厥(febrile seizure, FS)是儿科最常见的惊厥性疾病，其好发年龄为6月龄至5岁之间[1-2]。FS确切的发病机制目前尚不明确，其具有明显的年龄依赖性及家族遗传倾向，常为多基因遗传或常染色体显性遗传伴不完全外显[3-4]。此类患儿某些参与调节炎症反应和调控体温的炎症介质及细胞因子可能在此类患儿FS的发病机制中发挥着重要作用。由单核巨噬细胞产生的TNFα的启动子区238位点存在单核苷酸多态性，被认为可调节TNFα的转录水平，参与炎症反应过程和体温调控[5-6]。本研究通过分析单纯性热性惊厥(simple febrile seizure, SFS)和复杂性热性惊厥(complex febrile seizure, CFS)的临床特征，以及比较TNFα-238基因多态性在SFS和CFS患儿及健康人群中分布的差异,探讨TNFα-238基因多态性与中国汉族儿童FS发生的相关性，以期为预测FS的遗传易感性提供参考依据，同时从基因角度为FS的发病机制和治疗靶点提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年6月—2018年5月在上海市儿童医院急诊科诊治的108例FS患儿的临床资料，皆为汉族，其中男69例、女39例，男女比值为1.77∶1。纳入标准：符合美国儿科学会(APP)2011标准，FS为发热状态下(肛温≥38.5 ℃、腋温≥38.0 ℃)的惊厥发作。根据临床特征，将纳入FS组的患儿分为SFS亚组(82例，75.9%)和CFS亚组(26例，24.1%)。SFS表现为全身性发作，持续时间<15 min，1次热程中发作1次，无异常神经系统体征。表现为局灶性发作，持续时间≥15 min或1次热程中发作≥2次，符合3条中的1条即诊断为CFS[7]。排除标准：中枢神经系统感染；既往有癫痫病史者因感染诱发惊厥发作；既往有“无热惊厥”史；新生儿发热伴惊厥；由中毒性脑病、全身代谢紊乱、急性中毒或遗传代谢性疾病导致的惊厥发作。选择同期性别和年龄匹配的完成健康体检的汉族儿童108名，既往无FS史，设为健康对照(NC)组。本研究经医院伦理委员会审核和批准(批件号:2020R118-E01)，所有受试者入组前亲属均签署知情同意书。

1.2 实验方法与观察指标

1.2.1 一般资料 收集纳入患儿与健康儿童的年龄、性别、FS家族史、发生FS时的体温、惊厥类型、持续时间、血常规、血气分析和血电解质分析等临床资料。

1.2.2 DNA提取与基因型分型 FS组患儿抽搐后1 h内采集其静脉血2.0 mL，NC组留取体检时采集的血液样本2.0 mL。两组血液样本均置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，应用全血基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP304-03)，按其产品说明书步骤提取样本全血DNA。提取的DNA分装于洁净EP管中，保存于-80 ℃冰箱。采用高分辨率熔解曲线分析(HRM)法对TNFα-238基因位点多态性进行基因分型。应用Primer Premier 5.0软件进行多态性位点的引物设计，基因引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成。TNFα-238引物序列：5’-CAC ACA AAT CAG TCA GTG GC-3’(正向序列)，5’-GGA CAC ACA AGC ATC AAG GA-3’(反向序列)。HRM 10 μL反应体系：2×缓冲液1 μL，DNA 1 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.5 μL, 牛血清白蛋白(BSA) 1 μL, LC Grean荧光染料1 μL, 正向和反向引物序列(10 mmol/L)各0.5 μL,TaKaRa LATaq聚合酶0.1 μL, 剩余体积用三蒸水补足。HRM反应条件：95 ℃预变性90 s；95 ℃ 1 s，55 ℃ 1 s，72 ℃ 5 s, 共循环40次；72 ℃延伸90 s。TNFα-238 G/A的测序结果应用美国国立生物技术信息中心的BLAST软件与数据库中已知序列进行同源性分析，以验证基因多态性结果的正确性。

2 结 果

2.1 FS组患儿的临床特征 FS组患儿伴随的基础疾病包括：上呼吸道感染77例(71.3%)，支气管炎19例(17.6%)，胃肠道感染12例(11.1%)。SFS亚组患儿发作时体温显著高于CFS亚组(Z=-2.064，P=0.039)，发作后的血糖水平显著高于CFS组(Z=-1.895，P=0.048)；两组间其余实验室指标的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 SFS与CFS亚组患儿的临床特征及实验室结果比较

2.2 SFS亚组、CFS亚组和NC组TNFα-238位点基因型及等位基因频率的分布 3组TNFα-238多态性的基因型频率分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡(P值均>0.05)。本组研究群体中未检测到TNFα-238位点的AA基因型，3组间其他各基因型、等位基因频率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

表2 SFS亚组、CFS亚组和NC组TNFα-238位点的基因型及等位基因分布比较 [n(%)]

3 讨 论

FS是儿科惊厥发作最常见的原因。本组研究对象的临床资料显示：FS伴发的疾病以上呼吸道感染(71.3%)最为常见，在性别分布上无显著差异。本研究结果显示，SFS亚组发作时体温显著高于CFS亚组，发作后血糖水平亦显著高于CFS亚组。分析其原因：SFS组抽搐时的体温更高，高热导致机体处于高度应激状态,交感神经兴奋,使得儿茶酚胺、肾上腺皮质激素和胰高血糖素等分泌显著增加,抑制胰岛素分泌和释放，最终导致血糖水平升高。因此，对FS患儿尤其是SFS患儿建议监测其血糖水平，避免后续的含糖补液治疗或部分存在糖耐量异常儿童的高血糖症状加剧，从而损伤脑组织及其他重要脏器。多数SFS患儿惊厥持续时间较短，且能自行缓解，故预后大多良好。长时间、频繁的惊厥发作可引起不同程度的脑损伤，导致大脑海马组织硬化萎缩及神经元变性坏死，与颞叶癫痫、情感行为发育障碍、学习困难、智力发育落后等相关[1]，故对CFS患儿建议进行定期随访，必要时完善脑电图及头颅CT或MRI等检查。

FS的发病机制尚未完全明确，多数学者认为其与中枢神经系统发育不完善，以及脑内神经递质和免疫、遗传等因素有关[2]。FS发生在高体温或体温快速升高过程中，提示参与炎症和介导体温升高的细胞因子可能在FS的发病机制中扮演重要角色[8-9]。TNFα为一种典型的促炎性细胞因子和内源性致热原，可激活免疫细胞(如巨噬细胞、单核细胞等)促进血小板活化因子、细胞间黏附分子、血栓素A2、前列腺素E2等炎症因子分泌，参与机体对炎症及体温的调控过程[10]。既往研究认为，根据TNFα水平、靶细胞类型、暴露持续时间及特定的受体亚型的不同，TNFα可产生双向效应。在惊厥模型鼠脑内注射TNFα可诱发惊厥发作，在海马内微注射TNFα则能提高惊厥发作的阈值[11]；而在转基因小鼠的星形胶质细胞中过表达TNFα可诱导自发性惊厥发作。TNFα已被证实可增加海马区神经元兴奋性突触后传递时间而抑制γ-氨基丁酸(GABA)介导的抑制性突触传递，从而导致惊厥易感性增加[12]。Choi等[13]研究发现，FS反复发作的患儿血清TNFα水平较首次惊厥发作患儿显著升高。与惊厥持续时间较短的全身性癫痫伴FS附加症的患儿相比，呈无热癫痫持续状态的难治型癫痫患儿的血清TNFα水平较高，提示TNFα持续性表达可改变惊厥易感性。

TNFα基因定位于6p21.4，有4个外显子和3个内含子，位于启动子区的238位点，存在单核苷酸多态性，被认为可调节TNFα的转录水平，且与多种疾病的易感性相关[14-16]。目前已有的研究显示，TNFα基因多态性与FS的相关性结果尚存在争议。Zare-shahabadi等[17]在伊朗儿童的FS组与正常对照组的对比研究中发现，TNFα-238、-308 GG基因型在FS组中的分布显著高于对照组，提示TNFα-238、-308基因多态性在FS发病机制中起着重要作用。Khoshdel等[18]在研究伊朗儿童TNFα-308、-850基因多态性与FS的相关性时发现，TNFα-308、-850基因多态性与SFS无显著相关性，TNFα-308基因多态性与CFS具有相关性。Chou等[19]研究了中国台湾省儿童细胞因子IL-1β、IL-1Rα、IL-6、IL-8、IL-10、TNFα基因多态性与FS的相关性，结果显示，FS组与对照组IL-1Rα基因多态性分布的差异具有统计学意义，而未发现TNFα与FS具有相关性。目前鲜见TNFα-238基因多态性与FS的相关性研究。本研究采用HRM法检测FS组、NC组、SFS亚组和CFS亚组中TNFα-238基因多态性的分布。在本研究群体中，TNFα-238位点多态性仅存在GG、GA基因型,未检测到AA基因型，该位点各基因型及等位基因频率在上述各分组中分布的差异均无统计学意义。

TNFα-238基因多态性与FS相关性研究的结论存在不一致性，考虑其原因是散发的FS患者遗传机制较为复杂，可能是遗传与环境因素(免疫、神经递质等)共同作用所致，尚不能够通过单一基因型和等位基因频率的差异来阐明FS的发病机制。此外，FS可能是由多个基因多态性位点通过连锁作用对氨基酸编码剪切、转录表达和蛋白质结构等各个环节发生影响，进而调节基因功能。研究单个基因的单一基因多态性可能会割裂多个基因多态性之间的相互影响[20]。

综上所述，SFS患儿发作时体温和发作后血糖水平显著高于CFS患儿，这与SFS高热导致机体应激状态相关。应注意监测FS特别是SFS患儿的血糖水平，以预防高血糖所致的相关损害。在本研究群体中尚未发现TNFα-238基因多态性与中国汉族儿童SFS和CFS发生的相关性，后续应进一步完善大样本量、包含更大家系的研究来验证上述结论。