狮头鹅VIPR1 基因cDNA 全长克隆及组织表达研究

李 莹，文正亚，罗成龙，李婉婧，何静怡，张 盼，陈 鹏，范海霞，周 敏

(1.畜禽育种国家重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广东省农业科学院动物科学研究所，广东广州 5 106401；2.南昌师范学院生物技术研究所&江西地方鸡种遗传改良重点实验室，江西南昌 330029)

我国是世界养鹅大国，鹅品种资源丰富。狮头鹅是我国大型肉鹅的代表，具有体型大、生长快、饲养期短、耐粗饲、饲料转化效率高、适应性强等特点[1-2]，但其繁殖性能低下，平均235 日龄开产，因母鹅就巢性强，每产一窝蛋就巢1 次，就巢期为25～30 d，故年产蛋数仅26～29 枚[1]。繁殖性能低成为制约狮头鹅规模饲养及产业发展的核心因素。

下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-Pituitary-Gonadal Axis，HPG）调控动物生殖系统的发育和功能维持，禽类的繁殖性能受HPG 轴的高度调控，催乳素（Prolactin，PRL）是引起禽类就巢行为发生和维持的关键激素，血管活性肠肽（Vasoactive Intestinal Peptide，VIP）在家禽体内是一种生理性的PRL 释放因子，其生物作用主要通过位于细胞膜上的受体介导[3-4]。鸡[5-9]、火鸡[10-13]、鸭[14-16]、鹌鹑[17-18]等家禽中生理生化以及突变位点与繁殖性状相关性等研究均证明了该轴上的VIP及其I 型受体（Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 1，VIPR1）基因是影响家禽产蛋数、就巢性以及开产日龄等繁殖性状的关键候选基因。

在四川白鹅[19]、扬州鹅[20-21]、鸿雁[22]、浙东白鹅[23]、狮头鹅[24]研究中发现VIP与VIPR1基因mRNA 表达水平以及血清中VIP 浓度都随着鹅不同繁殖时期变化而改变，不同品种不同繁殖阶段也有显著性差异，从生理生化角度证明了VIPR1基因参与了鹅繁殖性能的调控。目前，VIPR1基因cDNA 序列已在鸡[5]、火鸡[12]、连城白鸭[14]、黑番鸭[15]、鹌鹑[17]中被克隆，该基因在鹅中仅有浙东白鹅部分编码区参考序列[23]，因此尚未有该基因功能深入研究报道。本研究利用RT-PCR、5'RACE和3'RACE 成功获得狮头鹅VIPR1基因cDNA 全长序列，并采用多种生物信息学分析软件分析所获序列及其编码的蛋白，利用qRT-PCR 完成狮头鹅VIPR1基因的组织表达谱分析，为深入开展VIPR1基因的功能研究，揭示该基因对就巢、产蛋等繁殖性状的影响提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 取广东饶平县财佳农业科技有限公司狮头鹅保种群115 日龄狮头鹅12 只（公母各半），屠宰后立即采集大脑、小脑、下丘脑、垂体、肉瘤、咽袋、胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾、肌胃、腺胃、十二指肠、胸腺、法氏囊、卵巢/睾丸、输卵管/输精管、背皮、腹脂等22 种组织，样品保存于RNAlater 中带回实验室，在-80℃冰箱中保存，所有组织用于基因表达规律分析。

RNAlater（Invitrogen，赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司），Trizol、DNaseI、TransScript®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、感受态细胞DH5α、DEPC、琼脂糖、DNA 胶回收试剂盒、DL2000 Marker 等均购自北京全式金生物技术有限公司。主要试剂包括：KOD FX (1.0 U/μL)（东洋纺上海生物科技有限公司），SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 与Advantage®2 polymerase Mix（Clontech，美国），pMD18-T载体（TaKaRa，大连），Taq Universal SYBR Green Supermix 与CFX96TMC1000 TouchTM Thermal Cycles（BIO-RAD，美国）。

1.2 狮头鹅各组织总RNA 提取及cDNA 合成 各组织总RNA 采用传统Trizol 法提取，用DNaseI 对总RNA进行消化，并用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 超微量分光光度计（Thermo，美国）检测其完整性以及纯度和浓度，保存于-80℃冰箱备用。取适宜体积总RNA（约2 μg）合成cDNA 第一链，并于-20℃保存。鸡、鹌鹑VIPR1基因在胃肠道表达量较高，因此选择十二指肠组织用于cDNA 全长扩增。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank 中鸡（登录号NM_001097523）、鹌鹑（登录号JF441057）等 的VIPR1 序列保守区域设计引物P1 与P2 用于获取cDNA部分序列；根据P1 与P2 所获序列设计P3、P4 引物用于扩增CDS 其他序列，引物P5 和P6 分别为5'RACE和3'RACE 的特异性引物；引物P7 用于各组织表达分析。根据鹅的GAPDH序列（登录号MG 674174）设计引物P8，用于各组织中GAPDH表达检测。使用GENETOOL 软件设计上述引物，并由湖南擎科生物技术有限公司合成，所有扩增引物如表1 所示。

表1 VIPR1 基因克隆及表达分析所用引物

1.4 狮头鹅VIPR1基因cDNA 全长克隆 以十二指肠组织总RNA 获取（第一链）cDNA 用于VIPR1 编码区、5'-UTR 和3'-UTR 序列扩增。cDNA 反转录、PCR 扩增体系及程序参照周敏等[17]及RACE 反应按照SMARTerTMRACE 试剂盒步骤进行。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒回收、纯化目的片段，将纯化后的目的片段与pMD18-T 连接、转化，培养后进行PCR 鉴定，挑取阳性菌落送于北京湖南擎科生物科技有限公司进行双向Sanger 测序。

1.5 狮头鹅VIPR1基因cDNA 生物信息学分析 获得的序列用NCBI 网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上BLASTN 在线对比工具检索VIPR1基因的核苷酸序列；用DNAStar 中的Seqman 进行拼接，拼接后的cDNA 序列的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）推断、不同物种氨基酸序列分析、蛋白结构功能预测分析、系统发生树构建参考周敏等[17]和马腾等[25]方法进行。

1.6 荧光定量PCR 检测狮头鹅VIPR1基因的组织表达 在CFX96TM C1000 TouchTM Thermal Cycles 荧 光定量PCR 仪上分别对狮头鹅公鹅与母鹅的22 种组织VIPR1mRNA 丰度进行定量检测，以GAPDH作为内参进行校正。qRT-PCR 反应体系参照吴磊等[26]配制，采用20 μL 反应体系：1 μL cDNA 模板，12.5 μL 2 × Q-PCR SYBR Green Mix，10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL，其余用ddH2O 补齐。反应程序为94℃ 4 min，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，40 个循环后进入熔解曲线程序55℃～95℃，升温速度0.5℃/10 s。每个样本均设3 个重复。

1.7 统计分析 以狮头鹅公鹅小脑的ΔCt 值作为不同组织间差异定量分析的参照，采用2-ΔΔCt法分析VIPR1基因在狮头鹅公母各组织中的相对表达量。使用SPSS 22.0 对定量结果进行显著性分析，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 狮头鹅VIPR1基因cDNA 克隆及序列分析 对狮头鹅VIPR1基因cDNA 编码区分别用引物P1～P4 进行扩增，电泳结果如图1 所示，分别得到288、415、657、707 bp 的扩增产物，与目的片段大小一致，测序后经比对确认为VIPR1序列；利用引物P5、P6 分别进行5'和3'RACE 扩增，分别获得421、767 bp 的目的条带，经比对确认为VIPR1的5'和3'端序列。将6 条序列拼接后获得长度为2 402 bp 的狮头鹅VIPR1cDNA 全长序列。

序列分析结果表明，狮头鹅VIPR1基因cDNA 序列 中CDS 区 为1 338 bp，5'-UTR 为203 bp，3'-UTR为861 bp，3'-UTR 区包含1 个ATAAA 加尾信号（图2）。该基因编码445 个氨基酸。本实验所获VIPR1基因编码区序列与浙东白鹅的部分序列比对发现4 个碱基的变异：A347G、C702T、G711A 与C1134T 分布在两个鹅种VIPR1基因编码区196～1 152 bp，其中A347G的突变造成1 个氨基酸的变异(116N →S)。

图2 狮头鹅VIPR1 cDNA 核苷酸及氨基酸序列

2.2 物种间VIPR1基因的一致性及进化分析 狮头鹅VIPR1基因的CDS 区序列与其他禽类的12 条序列一致性较高，均超过89.4%，其中和鸿雁一致性最高为99.8%，其次是浙东白鹅、黑番鸭，分别为99.6% 和97.2%，与斑胸草雀一致性最低为89.4%；与哺乳动物、两栖类、鱼类等14 个物种的一致性在67.0%～72.9%，其中与人、大鼠的最低，均为67.0%，与非洲爪蟾一致性最高，为72.9%（表3）。VIPR1基因氨基酸序列一致性分析发现，狮头鹅与哺乳动物、爬行动物和鱼类一致性均较低在65.5%～75.7%，与禽类的一致性均较高在90.1%～100.0%，其中与鸿雁一致性最高（100.0%），其次是浙东白鹅（99.7%），与猕猴和山羊的一致性最低（65.5%）（表3）。

为了分析狮头鹅VIPR1与其他物种在进化上的关系，基于各物种VIPR1的氨基酸序列，利用MEGA 6.0构建进化树，结果表明系统发育树分为四大类，哺乳动物、禽类、爬行动物和鱼类各自分别为一类，符合物种进化规律（图3），其中禽类可分为5 支，狮头鹅、浙东白鹅与鸿雁为一支，绿头鸭、连城白鸭、黑番鸭、凤头潜鸭为一支，棕硬尾鸭为一支，鸡、火鸡与鹌鹑为一支，斑胸草雀与原鸽为一支（图3）。

图3 不同物种VIPR1 氨基酸序列的系统进化树

2.3 狮头鹅VIPR1 蛋白结构和功能预测 通过ExPASy 在线工具预测狮头鹅VIPR1 蛋白特征，分析显示，该蛋白分子质量为51 107.02 ku，分子式为C2368H3601N589O614S30，理论等电点为8.56，摩尔消光系数为96 465，脂肪族系数为97.89，半衰期为30 h，不稳定系数达43.05，推测该蛋白为偏碱性不稳定的蛋白。VIPR1 蛋白质包含20 种常见的氨基酸，其中天冬氨酸频率最低（1.8%），亮氨酸频率最高（10.1%），其他氨基酸出现频率在2.7%～8.1%；带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu）有32 个，带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）有39 个。疏水性预测表明狮头鹅VIPR1 蛋白的总平均疏水性为0.362，推测该蛋白属于疏水性蛋白（图4-A）。Signal P 和TMHMM预测发现，VIPR1蛋白的N-端存在1 个由22 个氨基酸残基组成的信号肽，序列为MKSARLRVLLPLLGCLLSAASS，分界位点在22和23 号氨基酸残基间；包含7 个跨膜结构，分布在氨基酸序列的第133～380 号残基（跨膜位点依次为133～155、168～187、207～229、241～263、287～309、330～348 和358～380）。二级结构预测显示该蛋白含有α-螺旋、β-折叠和环，分别占比44.27%、12.36% 和43.37%；具有6 个N-糖基化位点，6 个蛋白激酶C 磷酸化位点，4 个N-肉豆蔻酰化位点，2 个酪蛋白激酶II 磷酸化位点，1 个cAMP 和cGMP 依赖的蛋白激酶磷酸化位点和2 个G 蛋白偶联受体B 亚族特征序列。用SMART 对该蛋白的结构域进行预测发现，VIPR1 蛋白在6～17 氨基酸位形成了一个low complexity 结构域，49～120 氨基酸位形成一个HormR 结构域；7 个跨膜区域（图4-B），与TMHMM Server 2.0 预测的位置一致。使用SWISS-MODEL 构建了狮头鹅VIPR1 蛋白三级结构，由25～396 位氨基酸残基构成，与VIPR1 蛋白的二级结构预测基本一致（图4-C）。

图4 狮头鹅VIPR1 蛋白结构与功能分析

2.4 不同组织mRNA 表达分析结果 采用qRT-PCR 方法检测VIPR1mRNA 在公母狮头鹅中22 种组织的表达情况，以GAPDH为参照基因，以公鹅小脑组织的表达水平作为对照，结果如图5 所示，VIPR1基因在公母狮头鹅的多个组织中普遍表达，但表达模式具有性别差异。VIPR1基因在狮头鹅的肺组织中表达水平最高分别为54.35 倍（公）与66.76 倍（母），其次为垂体分别为50.20 倍（公）与4.85倍（母）；肺与垂体组织的表达量在公狮头鹅中高于其他各个组织（P＜0.01），肺组织的表达量在母狮头鹅中高于其他各个组织（P＜0.01）；胸肌与腿肌中表达量在公母狮头鹅中均极低（0.01～0.03 倍）。

表2 狮头鹅与其他物种VIPR1 基因CDS 区的一致性分析

比较公母狮头鹅VIPR1基因在22 种组织中表达量的差异发现，垂体、肉瘤、性腺、咽袋与肝这5 种组织中公鹅与母鹅的表达量有极显著差异或显著差异，在其他17 种组织中的表达量无显著差异（图5）。

图5 狮头鹅公母VIPR1 在22 种组织的相对表达量

3 讨 论

自2001 年鸡[5]、火鸡[12-13]VIPR1基因全长cDNA 被成功克隆并报道其参与了繁殖性能的调控，随后鸭[14-16]、鹌鹑[17]等禽类的VIPR1基因的cDNA 序列被相继成功克隆，但缺乏鹅VIPR1基因cDNA 全长序列资料[23]。本研究通过RT-PCR 和RACE 技术成功获得了狮头鹅VIPR1基因cDNA 全长序列2 402 bp，由203 bp 5'-UTR、1 338 bp ORF 与861 bp 3'-UTR 组成，编码445个氨基酸残基。与GenBank 预测的鹅（swan goose）VIPR1CDS 相比，本研究获得的VIPR1基因CDS 在5' 端增加了87 bp，多编码27 个氨基酸，在1 251 bp CDS 序列中出现2 个碱基的变异（C702T、G711A），但这部分CDS 推导出来的氨基酸序列一致性为100.0%；与浙东白鹅相比[23]，狮头鹅有4 个碱基的变异，其中C1134T 出现在狮头鹅中，但这个变异是否是狮头鹅特有以及这些碱基的差异是否会影响狮头鹅VIPR1基因对繁殖性能的影响需进一步的实验论证。Ensemble blast 分析结果表明该基因包含13 个外显子，与鸡的结果一致[6]；但鸡中主要存在2 种剪接体[27]，而在本研究中未出现，与Ensemble 中swan gooseVIPR1预测的一致。狮头鹅VIPR1基因核苷酸序列和氨基酸序列一致性与其他24 个物种相比，狮头鹅VIPR1基因CDS与其他禽类一致性超过89.4%，其蛋白与其他禽类的一致性达到89.0%以上，表明该基因在禽类中高度保守；由进化树分析可知，狮头鹅VIPR1 蛋白与禽类、两栖类、哺乳动物与鱼类各自分别聚到一类。分析蛋白质空间结构及其理化特性是开展功能研究的基础，本实验结果表明狮头鹅VIPR1 蛋白为7 次跨膜、偏碱性不稳定蛋白，其信号肽区域存在多处磷酸化和N-糖基化位点，其胞外域与跨膜域中与功能密切相关的保守性基序如“RLAK”、“IIRIL”、“PDI/V”、“WD”、“NVSR/K”、“GWS/T”等与VIPR1在其他物种上的研究结果相符[28-29]。这些功能域和结构在进化上的高度保守性暗示了狮头鹅VIPR1基因具有与在其它物种类似的生物学功能。

在鸡[5]、火鸡[12-13]、鸭[14-16]与鹌鹑[17]等禽类中VIPR1基因位于垂体、下丘脑、小肠、肺等组织细胞膜上，且在垂体中高水平表达。VIP 与位于腺垂体细胞膜上的VIPR1 高亲和力的结合是催乳素合成和分泌的第一步[13]。张响英等[24]研究发现HPG 轴中VIP基因mRNA 的表达水平与狮头鹅催乳素分泌密切相关，催乳素是狮头鹅就巢行为维持和发展的关键激素。刘毅[23]采用qRT-PCR 检测了该基因在浙东白鹅第二产蛋周期：光刺激阶段（休产期之后开始产蛋之前的恢复时期）、产蛋期（连续产蛋时期）、就巢期、光松弛阶段与休产期5 个阶段繁殖期的下丘脑、肠、胰、肺、垂体、卵巢、输卵管、心、肝、肾10 种组织中的表达变化，发现该基因在浙东白鹅整个繁殖周期各个组织中都有表达，在HPG 轴中就巢期垂体的表达量最高，变化趋势与下丘脑VIP基因表达量和血液中PRL 浓度的变化一致。Zhu等[20-21,30]发现不同品种鹅在不同的光周期下VIPR1基因表达模式随繁殖期的不同而变化，且不同品种鹅间表达量有显著性差异。本实验结果显示，VIPR1基因在公母狮头鹅22 种组织中均有表达，但表达水平不同，肺组织表达量最高，垂体次之，与刘毅[23]、Zhu 等[20-21,30]研究结果相同，进一步揭示了VIPR1在狮头鹅中参与了繁殖调控。在所检测的HPG 轴中，公母狮头鹅垂体VIPR1基因mRNA 表达量显著高于其他2 个组织，与鸡[5]、火鸡[12]、鸭[14-15]和鹌鹑[17]中的结果基本一致，说明VIP 主要由位于垂体细胞膜上的VIPR1 介导从而调控PRL 功能；而性腺组织中表达量低可能是因试验所用狮头鹅处于未开产阶段所致。VIP 作为一种脑肠肽广泛分布于循环、免疫、生殖、消化系统以及中枢、外周神经系统，并且参与脑、肺、外周血管的血管舒张，以及消化道系统、支气管、子宫平滑肌的松弛以及胚胎的形成[31]，本研究发现鹅肺组织中VIPR1基因表达水平极显著的高于其他组织，与鸡[5]、火鸡[12]研究结果不同，推测该基因可能会影响鹅肺组织的功能，但需进一步的实验论证。

母鹅严重的就巢习性导致产蛋性能低下，目前对鹅繁殖性能的研究一般以母鹅为试验对象，集中在HPG轴候选基因的克隆及其在不同繁殖时期母鹅中的表达变化等，对公鹅的研究极少。研究表明催乳素受体基因mRNA 在公母鸡下丘脑、垂体中的表达有性别差异，且公鸡表达显著或极显著高于母鸡[32]。但VIPR1基因mRNA 的表达是否在禽类有性别差异还未见报道，本研究以性成熟未达产蛋（115 日龄）公母狮头鹅为对象，发现在所检测的22 种组织中垂体、肉瘤、咽袋、肝以及睾丸/卵巢这5 个组织中的表达具有性别差异，在肉瘤、咽袋、肝、睾丸/卵巢4 种组织中母鹅VIPR1基因mRNA 表达量分别是公鹅的2.04、2.45、2.70、6.86 倍，在垂体中公鹅的表达量是母鹅的10.35 倍；5 种有性别差异表达的组织中垂体、性腺的差异最大，暗示在以后研究中为了提高鹅产蛋性能不应只研究母鹅，还应对公鹅加以关注。

4 结 论

本研究成功克隆了狮头鹅VIPR1基因cDNA 全长序列，该序列长2 402 bp，包含1 338 bp 的CDS 区和203 bp 的5'-UTR 以 及861 bp 的3'-UTR 序 列，编 码445 个氨基酸。VIPR1基因在公母狮头鹅的多个组织中表达，其表达模式具有性别差异，其中肺、垂体组织中表达量较高。