外源性褪黑素促进哺乳动物卵母细胞成熟的研究进展

潘红梅，臧胜芹，张 亮，张凤鸣，李兴桂，周光斌*

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130；3.绥江县动物卫生监督所，云南绥江 657700）

在卵母细胞体内外发育过程中，母体老化、饲料中某些毒副因素、培养条件及玻璃化冷冻等均会引起活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）过量累积，造成氧化应激，导致卵母细胞减数分裂异常、基因表达紊乱以及凋亡等现象[1-2]，从而降低卵母细胞的发育潜力。因此，减少氧化应激损伤是促进卵母细胞发育成熟的关键。褪黑素（Melatonin，MT）又名N-乙酰基-5-甲氧基色氨，是由哺乳动物松果体中合成分泌的一种吲哚类激素，属于色氨酸的衍生物，能够降低卵母细胞内的ROS 水平[3]，缓解上述情况发生，促进绵羊、猪、牛、水牛、小鼠和人类卵母细胞和胚胎的发育[4-9]。本文从褪黑素对卵母细胞成熟的影响及其机制等方面加以综述，以期为褪黑素在家畜生殖调控中的应用提供参考。

1 褪黑素概述

褪黑素最早是由Lerner 等[10]在牛的松果体中分离得到的一类吲哚胺物质，其合成和分泌受光周期调节。光周期信息经哺乳动物视网膜神经节细胞接收，通过多突触神经通路传递至松果体，调节褪黑素分泌，影响昼夜节律和睡眠，甚至调控哺乳动物的季节性繁殖[11]。褪黑素也是一种强大的抗氧化剂和抗凋亡剂，具有直接清除自由基、调节抗氧化酶（如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶）的基因表达、减少活性氧和活性氮产生，防止细胞氧化损伤，保护细胞中的大分子物质等能力[12]。

褪黑素膜受体MTI 和MT2 均属于G 蛋白偶联受体家族，两者具有不同的分子结构、分子生物学特性和染色体位置[13]。褪黑素可通过膜受体、核受体视黄酸相关孤儿核受体（RORs）以及与细胞质分子的相互作用影响细胞生理[14]，影响p21和5-LOX等在细胞增殖中具有重要功能基因的转录[15]。

2 外源性褪黑素对哺乳动物卵母细胞的影响

2.1 外源性褪黑素有利于体内卵母细胞发育 体内正常发育过程中，卵母细胞处于低氧环境，卵泡液中含有的自由基清除剂和抗氧化酶可保护卵母细胞免受氧化损伤[16]。褪黑素作为抗氧化物质之一，能直接清除ROS 与自由基[17]；也可通过增加抗氧化酶和谷胱甘肽（GSH）的表达水平与活性来抑制促氧化酶从而减少细胞氧化损伤[18]。基于此，外源性添加褪黑素能改善非正常状态下母体（疾病、老龄）的繁殖力。其中，口服褪黑素可抑制过量ROS 产生，保护正常卵泡发育，治疗人卵巢早衰[19]。而在不同孕期小鼠饮水中添加褪黑素，早孕小鼠的胚胎着床、孕前黄体发育和子宫容受性都有所提高，这可能与褪黑素上调了参与卵巢孕烯醇酮合成和子宫内膜表达的基因有关[20]。外源性褪黑素对不同动物体内卵母细胞发育的影响见表1。

表1 外源性褪黑素对不同动物体内卵母细胞发育的影响

随着年龄增长，卵母细胞质量下降，高度老年化母体的卵母细胞减数分裂过程中非整倍体增多与卵泡液中褪黑素丰度的降低高度相关[21]。老龄小鼠卵母细胞暴露于外源性褪黑素不仅可以减少ROS 诱导的DNA 损伤和凋亡，还可以抑制由纺锤体/染色体缺陷引起的非整倍体的发生[22]。卵巢内卵母细胞数量和质量逐渐降低的过程被认为是哺乳动物生殖衰老的过程。有研究采用自然衰老小鼠模型，探讨褪黑素对卵母细胞质量影响的可能机制，数据表明，外源补充褪黑素能够显著降低老年小鼠卵母细胞减数分裂缺陷的发生率[23]。

2.2 外源性褪黑素可促进卵母细胞的体外成熟 体外培养过程中，卵母细胞对温度、渗透压、氧气、营养限制、pH 和毒素等[26]外源因素的变化高度敏感，易产生大量ROS，引起细胞DNA 损伤、线粒体功能紊乱、早期凋亡等，进而影响卵母细胞的成熟。褪黑素作为一种强有力的抗氧化剂和自由基清除剂，能显著降低细胞内ROS 水平，清除自由基，促进卵母细胞的体外成熟。

2.2.1 褪黑素可降低卵母细胞氧化应激水平 体外成熟（IVM）卵母细胞处于一个相对高氧的环境，缺乏自由基清除剂和抗氧化酶保护，容易产生过量ROS，从而表现出较低的质量和发育潜力。褪黑素能够有效缓解氧化应激，显著降低早期凋亡水平，提高卵丘卵母细胞复合物（COCs）的发育，提高卵母细胞核成熟，颗粒细胞扩张、有助于受精、卵裂及囊胚的形成和发育。研究表明，体外成熟培养液中添加 10-9mol/L 褪黑素可有效缓解牛卵母细胞氧化应激，提高卵母细胞成熟率，保护其纺锤体与线粒体完整性，改善其表观修饰，从而提高卵母细胞质量和发育潜力，并显著促进后续克隆胚胎和体外受精胚胎的发育[16]。褪黑素可提高猪腔前卵泡卵母细胞-颗粒细胞复合体的发育能力[6]。添加10-7mol/L褪黑素可通过促进网格蛋白介导的内吞作用，促进人卵母细胞成熟和早期胚胎发育[27]。在山羊幼年卵母细胞体外成熟过程中，添加褪黑素可降低ROS 水平和提高线粒体活性，提高幼年山羊卵母细胞的发育能力[28]。

2.2.2 褪黑素能够改善卵母细胞线粒体功能 线粒体合成的ATP 是卵母细胞发育所需能量的重要来源[29]。高氧环境下，线粒体基因组 (mtDNA) 由于无核膜包被、无组蛋白保护等极易受到自由基攻击而损伤[30]。当线粒体功能受损时，除通过线粒体自身的碱基切除修复、错配修复等机制减少损伤外，外源补充褪黑素可改善卵母细胞质量，提升卵母细胞发育潜力。褪黑素可通过有效抑制IVM 培养过程中的环境应激，降低细胞内过量的Ca2+水平[31]，维持卵母细胞线粒体氧化磷酸化功能，为后续胚胎发育提供充足ATP[32]。GV 期卵母细胞玻璃化冷冻会使线粒体膜电位和ATP 含量下降，异常纺锤体增加，而添加褪黑素可显著缓解上述现象[33]。类似地，褪黑素也可改善绵羊卵母细胞线粒体功能，促进其恢复减数分裂[34]。综上，褪黑素可优化线粒体功能，在IVM 期间保持卵母细胞线粒体膜电位，增加ATP 含量，促进卵母细胞的发育。

2.2.3 褪黑素能够保护卵母细胞免受某些环境毒素的损害 随着污染越来越严重，环境中某些有毒物质对卵母细胞会产生毒副作用。研究发现，减数分裂成熟过程中，小鼠卵母细胞暴露在苯并芘（B[ghi]P）中会引起卵母细胞质量下降，加入褪黑素后能缓解该现象[35]。褪黑素对双酚A（BPA）诱导的小鼠卵母细胞质量恶化有挽救作用[36]。此外，动物采食的饲料中也可能会含有一些毒副物质。如灭草净（Fenoxaprop-ethyl，FE）可破坏卵母细胞骨架的完整性和诱导过量ROS 积累而导致卵母细胞减数分裂异常，而褪黑素可缓解灭草净导致的缺陷[37]。褪黑素还可以抑制卵丘细胞中黄曲霉毒素B1（AFB1）的代谢[38]。有研究报道了赭曲霉素（OTA）对猪卵母细胞质量的毒性以及褪黑素对OTA 暴露的卵母细胞具有保护作用[39]。MEHP 是增塑剂（DHEP）在体内的活性代谢物，研究发现褪黑素对MEHP 诱导的猪卵母细胞减数分裂缺陷有明显的改善作用[40]。

3 褪黑素对卵母细胞体外成熟后继续发育的影响

目前，猪、牛、羊等家畜的体外胚胎囊胚发育率分别 为17.9%[41]、37.1%～52.8%[42]、34%～43.4%[43]，很 大程度上限制了体外胚胎的生产效率，因此改善体外成熟卵母细胞的发育效率至关重要。哺乳动物卵母细胞体外成熟培养基中添加一定浓度的褪黑素有利于调节细胞器正常分布，增加GSH 和 ATP 含量，提高抗氧化基因表达水平，进而促进卵母细胞受精和发育能力[44]。褪黑素处理山羊幼年卵母细胞，受精后第8 天检测发现细胞内ROS 水平显著低于对照组，线粒体活性和ATP 含量均有所提高，囊胚质量得到改善[28]。生理浓度（10-9mol/L）的褪黑素不仅能促进猪卵母细胞的成熟率，也会增加孤雌胚泡的囊胚率和细胞数量[45]。当培养液中褪黑素的添加浓度过高（如10-3mol/L）时，可能对着床前胚胎有一定的毒性作用，胚胎体外孵化率仅为15%，显著低于10-9mol/L 添加组[9]。不同物种卵母细胞或胚胎体外发育过程中添加适宜褪黑素浓度详见表2。

表2 不同物种卵母细胞体外发育过程中添加适宜外源性褪黑素浓度范围

4 褪黑素促进卵母细胞体外成熟的潜在机制

褪黑素以膜受体依赖或非依赖方式保护卵母细胞，降低氧化应激损伤，促进卵母细胞体外成熟。

4.1 膜受体依赖方式 研究表明，牛卵母细胞和卵丘细胞细胞膜上均检测到褪黑素受体（MTl 和MT2）的表达[46]，而有研究显示，牛卵母细胞的细胞膜上两类受体均表达，但卵丘细胞的细胞膜上只有MT2 受体[47]。尽管如此，当卵母细胞成熟液中添加褪黑素受体激动剂或拮抗剂时，受体激动剂改善牛卵母细胞体外成熟，拮抗剂抑制牛卵母细胞成熟，表明褪黑素的确可通过其受体信号通路作用促进牛卵母细胞体外成熟[46]。类似的研究也显示，猪的卵丘细胞和颗粒细胞中有褪黑素受体mRNA 表达，褪黑素可能通过受体介导直接对卵母细胞成熟起作用[48]。

褪黑素受体可通过G 蛋白偶联受体介导的信号抑制cAMP 信号转导级联反应，调节细胞活动。MT1 激活可下调细胞内激活蛋白激酶A（PKA）活性，抑制AC/ cAMP/PKA/cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路，进而降低cAMP 的生成，刺激钾离子通道和细胞内信号传导；活化的MT1 还可诱导一过性的胞质钙离子与磷酸肌醇浓度升高[49]。而MT2 受体激活蛋白激酶C（PKC），诱导细胞内Ca2+释放。褪黑素通过膜受体介导机制上调卵母细胞成熟相关基因GDF9和MARF1、表观遗传修饰基因DNMT1a、卵丘扩张基因PTX3和HAS1/2的表达水平，进而促进卵母细胞的成熟[46]。此外，褪黑素也能与核受体RZR/RORa结合，进而引起 RZR 调控元件结合p21和5-脂氧合酶等基因的启动子，从而调控转录[50]。

4.2 非受体依赖方式 单细胞RNA 测序发现，外源褪黑素可通过上调线粒体氧化磷酸化通路中与ATP 生成相关COX17、ATP6V1G2等6 个基因，有效抑制人卵母细胞IVM 培养期间的环境应激，较好地维持线粒体氧化磷酸化功能和ROS 生成与抗氧化能力之间的平衡，为后续胚胎发育提供足够ATP[32]。Bcl-2（抗凋亡基因）或Bax（促凋亡基因）表达量的高低对细胞是生存或死亡起决定作用。在绵羊卵母细胞体外成熟培养基中添加褪黑素，可上调Bcl-2 和下调Bax 的表达，促进卵母细胞体外成熟以及其孤雌激活后的胚胎发育[51]。

褪黑素对AKT 抑制有显著的保护作用[5]。添加褪黑素显著阻止了AKT 抑制剂在卵母细胞成熟过程的抗发育作用，最终改善了核成熟、卵丘细胞扩张、早期卵裂，和第8 天囊胚的发育速度。对AKT 基因水平和蛋白水平的检测结果显示，褪黑素和AKT 信号通路之间存在互作效应，有利于卵母细胞成熟和胚胎发育[5]。

外源性褪黑素还可通过Sirt1/Sod2依赖机制逆转老化卵母细胞的表型缺陷，使卵母细胞Sirt1 及Sod 的蛋白表达水平上升，降低ROS 水平和DNA 损伤，使PGC1-α的蛋白表达水平上升，进而使ATP5a1等基因的表达水平上升，增加线粒体拷贝数，提升线粒体功能[22]。研究发现褪黑素可通过SIRT1-MnSOD依赖的途径延缓小鼠排卵后卵母细胞老化，为褪黑素在辅助生殖技术领域的进一步应用提供分子机制支持[52]。褪黑素也可诱导衰老小鼠卵母细胞中Sirt2的表达，降低H4K16 的乙酰化水平，进而促进微丝微管连接的建立和减少减数分裂的缺陷[53]。

哺乳动物的卵母细胞在MI 前期停留的时间较长，容易造成DNA 损伤的积累。积累的DNA 损伤会增加卵母细胞中染色体断裂、纺锤体异常、线粒体聚集和氧化应激，进而导致卵母细胞质量恶化。褪黑素也可通过加强非同源末端连接（NHEJ）促进DNA 修复，保护卵母细胞在早期停滞期间免受DNA 损伤，同时防止卵母细胞在减数分裂成熟过程中质量的恶化，改善小鼠卵母细胞质量[54]。最近，研究者在小鼠视网膜上又发现了组织特异性应答褪黑素的新机制[55]。由此可见，褪黑素对哺乳动物机体，以至哺乳动物卵母细胞的作用机制是多方面的，还需继续展开深入的研究。

5 小结与展望

综上所述，不同物种卵母细胞在体内外成熟过程中，补充适宜浓度的外源性褪黑素可保护卵母细胞免受氧化损伤或某些毒素的损害，主要通过降低氧化应激水平，减少DNA 的损伤、抑制早期凋亡、维持线粒体功能、改善纺锤体形态和恢复微丝微管肌动蛋白的活力及降低卵母细胞非整倍体的产生几率，从而提高卵母细胞的成熟比例和质量，进而提高精子与卵母细胞的结合能力，促进早期胚胎的发育潜力。褪黑素对哺乳动物卵母细胞的保护作用机制复杂多样，它们可通过多种通路互作，协同作用，而具体是如何协同互作发挥有益调节作用的，还需要广大研究人员不断探索。