冰鲜鸡预冷过程中微生物菌群多样性动态分析

王 倩，唐敏敏，孙芝兰 ，刘 芳，徐为民, ，王道营，李金平，马晶晶

（1.南京农业大学食品科技学院, 江苏南京 210095；2.江苏省农业科学院, 江苏南京 210014；3.徐州鑫科食品有限公司, 江苏徐州 221637）

冰鲜鸡是指活鸡被宰杀后，胴体经严格的检疫制度检验完成后进行冷却处理，使得温度在1 d内降至0~4 ℃的范围内，然后包装并在后续的一系列过程中使温度维持在此范围内的鲜鸡[1]。研究发现，在生产加工过程中，预冷是冰鲜鸡质量控制的关键环节。经过预冷减菌工艺环节后，鸡胴体表面微生物的生长得到抑制，贮藏期得到延长，品质得到良好的保持[2]。目前，水冷是我国生鲜禽生产最常用的预冷方式。预冷工序采用前后两段式，两段水均为流动水，一阶预冷池水温18 ℃，二阶预冷池水温10 ℃。水的流动方向与鸡胴体流动的方向相反。其中前段预冷水主要用次氯酸钠减菌消毒，后段为浸泡清洗[3]。胴体在预冷工序中所花时间约为20 min。宰杀的生鲜鸡通过预冷水后，降低了部分微生物的含量如葡萄球菌和肠杆菌等[4]，但随着预冷时间的增长，预冷水中的部分微生物含量增高，这时预冷水已经失去了清洗的作用，可能会对生产后期的鸡肉造成污染[5]。因此研究预冷水及冰鲜鸡预冷过程中的微生物组成及动态变化是揭示冰鲜鸡质量安全与腐败菌群的关系，保证冰鲜鸡品质稳定性的关键。

传统方法分析微生物群落多样性及群落结构需要先对可培养微生物进行分离、鉴定，再进行分析，并不能全面评估微生物群落的组成及结构[6−7]。高通量测序法近来作为一种新的分子生物技术，具有高效、快速、通量高的特点[8]，能对整个样品中的微生物种类和相对数量有一定的分析，可以更全面地反映微生物的群落特征[9]。目前高通量测序应用于香肠、龙虾、鲫鱼等[10−12]微生物群落分析中。但鲜有报道将高通量测序技术运用到测定肉鸡屠宰预冷过程中预冷水、鸡胴体的微生物群落结构及多样性分析的研究中。

本文采用高通量测序的方法对江苏某冰鲜鸡加工厂，肉鸡屠宰预冷过程中预冷水、鸡胴体的微生物群落结构进行动态分析，研究二者优势菌群的消长规律，为预冷工序的优化提供参考依据，同时为冰鲜鸡产品的质量安全提供保障。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄母鸡（日龄115 d，均重1000~1200 g） 某大型活禽屠宰车间；平板计数琼脂培养基 北京陆桥有限公司；氯化钠 广东光华科技股份有限公司；Omega Stool DNA Kit试剂盒、2 × Taq Plus Master Mix 南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

UniCen MR台式冷冻离心机 德国Herolab公司； LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；WGZ-200AP浊度仪 上海元析仪器有限公司；HZ-9211K型恒温振荡器 太仓科教器材厂；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；T-25数显匀浆器 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 从江苏某冰鲜鸡屠宰加工企业的预冷环节取样（环境温度为15 ℃）。在净膛间分别用红、黄、蓝、桔、绿色脚环绑鸡爪做标记，每种颜色脚环绑定5只鸡，分批次进入预冷水，上一批和下一批测定时间间隔为2 h。第一批红色脚环鸡刚进预冷水（每批鸡为1000只）时开始计时，一阶预冷水处理15 min，二阶预冷水处理15 min；通过一阶预冷水时，取一阶预冷水样置于无菌取样袋中；通过二阶预冷水时，取二阶预冷水置于无菌取样袋中；并取通过二阶预冷水5只红色脚环鸡置于无菌取样袋中，冰运至实验室。此后每隔2 h，取第二批、第三批、第四批、第五批鸡通过时，一阶、二阶预冷水和鸡胴体，取样方法同上。

1.2.2 预冷水菌落总数的测定 从每批次的一阶、二阶预冷水样液中各取1 mL样液依次10 倍梯度稀释后，选取三个合适的连续梯度，从每个稀释度中各取1 mL的稀释液倒入培养皿，倾注15~20 mL平板计数琼脂培养基，待凝固后于37 ℃培养箱中倒置培养，24~48 h后长出菌体取出计数。

1.2.3 鸡胴体菌落总数的测定 在 0、2、4、6、8 h时，分别取5只经二阶预冷水预冷后的冰鲜鸡，分别称量其体重加同等质量的水稀释一倍，于摇床(4 ℃，200 r/min)摇晃20 min，而后取上清液依次10倍梯度稀释，选取三个合适的连续梯度，从每个稀释度中各取1 mL的稀释液移入培养皿，倾注平板计数琼脂培养基，待凝固后于37 ℃倒置培养，24 ~48 h后长出菌体取出计数。

1.2.4 浊度的测定 采用WGZ-200型号的浊度仪直接测量一阶、二阶预冷水的浊度，每个样品测定3次，取其平均值。

1.2.5 样品总DNA的提取及PCR扩增 分别取10 mL一阶预冷水、二阶预冷水、鸡胴体在生产0、4、8 h时未稀释的样液，在4 ℃，12000 r/min低温离心15 min去除上清液收集沉淀，质检DNA，将合格样品置于−80 ℃保存。使用Omega Stool DNA Kit试剂盒提取基因组DNA，使用Nanodrop检验DNA质量和浓度。以338F和806R(5'－ACTCCTACGGGA GGCAGCAG－3'，5'－GTGGACTACHVGGGTWT CTAAT－3') 作为引物对细菌的16S rDNA V3－V4区进行序列扩增。PCR 采用25 μL反应体系：总DNA 30 ng，2 × Taq Plus Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，添加双蒸水 7.5 μL 补充至 25 μL。PCR 条件：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃ 变性 45 s，55 ℃退火 50 s，72 ℃ 延伸 45 s，共 28个循环；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。

1.2.6 16 S rDNA测序及菌相分析 首先进行数据质控，通过序列拼接、过滤和去嵌合体后得到优化序列，然后进行OTU聚类及注释[13−14]。基于聚类结果，可以进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析[15−16]；基于注释结果，可以得到各水平的分类信息，从而进行样本组成及样本间群落结构差异相关分析。

1.3 数据处理

每个指标重复3次试验，利用Origin8.0图形分析处理软件进行数据处理[17]，并用统计学软件SPSS 17.0[18](IBM公司)对数据进行单因素方差分析，进行显著性比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌落总数的变化

2.1.1 预冷水中菌落总数的变化 由图1A可知，一阶、二阶预冷水的菌落总数与时间呈正相关，随着生产时间的延长均呈递增的趋势；在生产过程中，二阶预冷水的菌落总数始终低于一阶预冷水，说明一阶预冷水起到较好的减菌效果。一阶预冷水在第一批鸡通过预冷水时（每批鸡为1000只）菌落总数为3.2 lg CFU/mL，在2 h时菌落总数上升为4.17 lg CFU/mL，在生产2~6 h时菌落总数在4.17 lg CFU/mL缓慢增长至4.64 lg CFU/mL，在8 h时，菌落总数达5.34 lg CFU/mL，高于此时鸡胴体的菌落总数，说明此时的预冷水失去了清洗减菌的作用，这与王华伟等[19]研究发现的预冷水在前中期的减菌效果良好，但随生产的进行减菌效果降低最后失去减菌效果的结果一致。二阶预冷水在第一批鸡通过预冷水0~2 h，菌落总数从2.0 lg CFU/mL骤升到4.3 lg CFU/mL，推测原因经过一阶预冷水的鸡胴体菌落总数仍然较高，进入二阶预冷水后，进一步清洗减菌；在4~8 h时，菌落总数缓慢上升，说明二阶预冷水菌落总数在这个时间段内渐渐趋于饱和。

图1 生产过程中预冷水的菌落总数(A)、浊度(B)Fig.1 The total number of colonies (A) and turbidity (B) of the pre-cooling water during the production process

由图1B可知，一、二阶预冷水的浊度与生产时间呈正相关，随着生产的进行，预冷水中的浊度上升；不同生产时间预冷水的浊度差异性显著(P<0.05)。一阶预冷水在第一批鸡通过预冷水2 h时浊度为137 NTU，说明鸡胴体表面物质较多，而一阶预冷水清洗鸡胴体后，浊度上升。在生产过程中二阶预冷水的浊度一直低于一阶预冷水，说明鸡胴体经过一阶预冷后胴体表面杂质变少，一阶预冷水起到了良好的清洗效果。

2.1.2 预冷过程中冰鲜鸡菌落总数的变化 细菌的数量是产品腐败的重要指标[20−21]。预冷过程中鸡胴体菌落总数的变化如图2所示。预冷之前，鸡胴体的菌落总数为4.53 lg CFU/mL，经预冷后第一批鸡通过预冷水0 h时，鸡胴体的菌落总数为3.98 lg CFU/mL，说明在0 h时，预冷水对鸡胴体起到了良好减菌作用；随着生产时间的延长，鸡胴体的菌落总数呈增长的趋势；与预冷水的菌落总数变化趋势一致，而在生产4 h时鸡胴体的菌落总数为4.3 lg CFU/mL，虽低于预冷前的菌落总数，但明显高于0 h时的菌落总数，说明随着时间的延长，预冷水的减菌效果降低；在6~8 h内，鸡胴体表面菌落总数高于（P<0.05）预冷前，说明预冷水已经失去了清洗减菌的作用，可能会对鸡胴体造成交叉污染。

图2 预冷过程中冰鲜鸡菌落总数的变化情况Fig.2 Changes in the total number of colony of cold fresh chicken during pre-cooling

2.2 物种注释

2.2.1 DNA扩增结果 细菌的16S rDNA具有物种特异性、分子大小适中、突变率低的特点，是鉴定细菌种类理想的分子标签。样本的16S rDNAV3-V4区序列扩增的电泳图如图3所示。从图3中可以看出，PCR产物目标条带正确，总量满足建库需要。

图3 PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplification products

2.2.2 预冷水和鸡胴体测序数据统计 经质控处理和OTU聚类，预冷水和鸡胴体细菌的序列统计如表1所示，不同时间的预冷水和鸡胴体，共计30个样品中一共产生1178个OTU。另外，如图4所示，30个样品共得1898265条有效序列，序列长度多在420~440 bp 之间。

图4 序列分布Fig.4 Sequence distribution

表1 预冷水和鸡胴体不同时间下细菌的序列统计Table 1 Sequence statistics of bacteria in pre-cooled water and chicken carcass at different times

2.2.3 基于属水平的样品细菌群落丰度 由图5A可知，在第一批鸡通过预冷水时，一阶预冷水中主要优势菌有气单胞菌属Aeromonas(34.7%)，假单胞菌属Pseudomonas(23.8%)，不动杆菌属Acinetobacter(9.03%)；在 4 h 时，Pseudomonas(75.8%)丰度明显增加，Aeromonas(13.1%)丰度减小，Acinetobacter(2.67%)丰度降低，假单胞菌属相对丰度比例增大，可能是因为鸡胴体中携带的假单胞菌在预冷清洗过程中进入预冷水，从而使假单胞菌属的丰度上升成为最主要的优势菌，其他菌落相对丰度的比例减小；在8 h时，Aeromonas(18.1%)丰度明显下降，说明预冷对气单胞菌属有较好的减菌效果；链球菌属Streptococcus(16%)明显增加，可能是因为鸡胴体携带的链球菌属污染了一阶预冷水从而使其丰度明显增加。

由图5B可知：二阶预冷水在第一批鸡通过预冷水 0 h时，主要优势菌群Acinetobacter(67.3%)，Pseudomonas(5.76%)，杜擀氏菌属Duganella(4.46%)，黄杆菌属Flavobacterium(3.55%)；在 4 h和 8 h时，Acinetobacter丰度分别为27%和16.8%，丰度显著下降；而Pseudomonas显著增加，分别为19.1%和29%。说明不动杆菌对温度敏感，二阶预冷水对其有较好的减菌效果，但对假单胞菌无减菌效果。

从图5C中可知：初始鸡胴体的主要优势菌属有魏斯氏菌Weissella(28.9%)、乳球菌属Lactococcus(11.2%)、漫球菌属Vagococcus(11.1%)、Streptococcus(9.2%)；经预冷后Weissella和Vagococcus相对丰度降低，说明预冷水对此二种菌属具有减菌效果；而鸡胴体的金黄杆菌属Chryseobacterium、Pseudomonas和Acinetobacter相对丰度上升，可能是因为其它菌丰度下降所致，同时也说明预冷水对此三种菌减菌效果不佳；Other丰度增加，说明在8 h时鸡胴体菌群的丰富度增加，在8 h时一阶预冷水反而对鸡胴体造成了污染。

图5 一阶预冷水(A)、二阶预冷水(B)和鸡胴体(C)基于属水平的物种组成分析Fig.5 Species composition analysis of first(A) and second order pre-cooling water(B) and chicken carcasses(C) based on genera level

综上所述，在预冷后期，Chryseobacterium、Pseu domonas、Acinetobacter上升为鸡胴体的优势菌属，尤其Chryseobacterium与Acinetobacter为条件致病菌[22−23]，在加工过程中应采取措施对它们进行控制。

2.3 预冷水和鸡胴体细菌类群的Alpha多样性分析

2.3.1 稀释曲线 稀释性曲线[24]可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理。由图6A可知：通过上述3个时间段的样品丰度比较得出，一阶预冷水生产0 h时OTU数量最多，因此0 h时微生物多样性丰富度最大，这与一阶预冷水共有OTU分析一致。由图6B可知，二阶预冷水生产4 h时OTU数量最多，4 h微生物多样性丰富度最大。由图6C可知鸡胴体在生产8 h时OTU数量最多，因此8 h时微生物多样性丰富度最大。

图6 一阶预冷水(A)、二阶预冷水(B)和鸡胴体(C)的稀释曲线Fig.6 Dilution curves of first(A) and second order pre-cooling water(B) and chicken carcasses(C)

2.3.2 Shannon曲线 Shannon[25]是反映样本中微生物多样性的指数，利用各样本的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性[26]。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物信息。从图7中可看出：10个样本的曲线的趋势先是上升然后趋向平坦，说明测序量足够大，数据真实可靠。一阶预冷水在0 h的Shannon数值高于4 h，低于8 h，说明一阶预冷水在4 h时减菌效果较好，对部分微生物有减菌作用所以导致微生物多样性降低；而在8 h时减菌效果较差。

图7 一阶预冷水(A)、二阶预冷水(B)和鸡胴体(C)的shannon曲线Fig.7 Shannon curves of first-order pre-cooled water (A), second-order pre-cooled water (B) and chicken carcass (C)

二阶预冷水在4 h和8 h的Shannon数值高于0 h，这可能是因为二阶预冷水在4 h和8 h的减菌效果不佳。与预冷前相比，鸡胴体在0 h和4 h的Shannon数值较高，说明预冷水在0 h和4 h时有减菌效果，从而鸡胴体微生物多样性降低；而在8 h时预冷水失去减菌效果，鸡胴体微生物多样性升高，这与鸡胴体菌落总数分析结果一致。

2.4 预冷水和鸡胴体细菌类群的Beta多样性分析

根据属水平上的菌群物种组成及相对丰度，采用 UPGMA 方法对各取样点进行聚类分析[27]，结果如图8所示。一阶预冷水、二阶预冷水在冰鲜鸡通过预冷水0 、4 、8 h时分别聚集在同一分支，说明一阶预冷水、二阶预冷水在这三个时间点的菌落组成相似。鸡胴体在冰鲜鸡通过预冷水0 h时和不同时间一阶预冷水聚集在同一个分支，说明在鸡胴体通过预冷水0 h时的菌落组成和一阶预冷水菌落组成相似，这可能是因为在0 h是一阶预冷水对鸡胴体有减菌作用；4、8 h的鸡胴体和二阶预冷水在同一分支，可能是因为4、8 h时二阶预冷水的微生物种类趋于饱和，鸡胴体通过二阶预冷水时和二阶预冷水的菌落组成相似，这与二阶预冷水菌落总数分析结果一致；预冷前的鸡胴体单独在一个分支，可能是因为鸡胴体没有通过预冷水，与预冷水没有产生交叉污染，所以预冷前鸡胴体和预冷水菌落组成差别比较大。

图8 一阶预冷水(A)、二阶预冷水(B)鸡胴体(C)的样本聚类分析Fig.8 Sample cluster analysis of first-order pre-cooled water(A) and second-order pre-cooled water (B) chicken carcass (C)

3 结论

通过菌落总数监测一阶预冷水、二阶预冷水、鸡胴体在生产过程中总菌数的动态变化，随生产时间延长，一阶预冷水的菌落总数呈增长的趋势，在生产4 h时后预冷水失去了减菌作用。二阶预冷水的菌落总数随生产时间的延长呈递增的趋势，在0~2 h内对鸡胴体有一定的减菌效果，在4~8 h时内二阶预冷水的菌落总数趋于饱和。鸡胴体变化趋势与一阶预冷水变化趋势相对应，这与姚丽峰等[28]研究中后续的冲洗和预冷工序未起到较好的减菌效果结果一致。

通过高通量测序技术对预冷水和鸡胴体不同生产时间的菌群多样性和菌群结构进行分析，从属水平上看，随着生产进行，一阶、二阶预冷水中假单胞菌属、链球菌属、假节杆菌属丰度增加，可能是因为鸡胴体中的微生物清洗入预冷水所致，同时也说明预冷对这三种菌减菌效果不明显。鸡胴体经预冷后漫球菌属、魏斯氏菌减少，金黄杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属增加，说明预冷工艺对漫球菌属、魏斯氏菌有较好的减菌效果，对黄杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属减菌效果不佳，这可能会成为贮藏过程中的潜在污染菌[29]。其中链球菌属中主要A群链球菌和肺炎链球菌对人体有致病性[30]，所以可进一步研究鸡胴体表面链球菌属的致病性。

预冷是冰鲜鸡加工过程中质量安全控制的关键环节[31]，从群落结构动态分析可以看出，在预冷后期控制不动杆菌属、金黄色杆菌属、假单胞菌属等优势菌属的生长，减少鸡胴体和预冷水的交叉污染尤为重要。此外，在本研究的基础上，可对预冷后期污染严重的预冷水进行膜处理后回流至预冷池进行循环利用，改善预冷工艺及降低冰鲜鸡的初始菌株、延长其货架期的问题进行进一步研究。