癫痫患者血清高迁移率族蛋白1与TOLL样受体4的表达及影响因素

叶嘉颖，杨炼红

（中山大学孙逸仙纪念医院神经科，广东广州 510120）

目前，癫痫（epilepsy）的病因和病理生理机制尚不明确，越来越多的学者提出癫痫与免疫应答、炎症反应相关［1］，近期有研究发现动物癫痫模型和体外模型中TOLL样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）与高迁移率族蛋白1（high-mobility group box 1，HMGB1）等免疫炎症标志物异常表达［2-4］，但临床癫痫患者中是否存在类似的免疫学改变，少有报道。因此，本研究采用前瞻性观察性临床研究方法，检测癫痫患者血清中HMGB1与TLR4的水平并对其进行影响因素分析，探究HMGB1、TLR4在癫痫中的作用和意义，以及影响HMGB1、TLR4表达的因素，增加对癫痫及难治性癫痫（intractable epilepsy，IE）分子机制的了解。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月-2017年9月期间于我院确诊的原发性癫痫患者74例作为实验组。依据实验组患者对AEDs治疗的反应性，将实验组分为药物难治组（19例）、药物有效组（31例）、分类不明组（24例）三个亚组。记录实验组患者年龄、性别、临床表现（起病年龄、发作类型、发作频率、末次发作时间、用药情况）、脑电图、头颅MRI等临床资料。选取同时期来我院体检的健康者43例作为对照组。2组在性别、年龄方面无明显差异，P＞0.05，具有可比性。

1.2 实验组入排标准

实验组入组标准：①参考国际抗癫痫联盟（ILAE）及国际癫痫局（IBE）制定指南［5-6］，结合临床表现、脑电图、头颅影像学检查、家族史诊断为原发性癫痫。②病史资料完整，已获家属知情同意，经过伦理委员会的批准。

实验组排除标准：①颅内肿瘤、颅脑感染、头颅外伤或手术后、缺血缺氧性脑病、神经系统发育异常、神经系统退行性疾病等神经系统疾病。②急慢性感染、肿瘤、风湿免疫性疾病等全身系统疾病；近1月内重大创伤或手术治疗。③过去6个月糖皮质激素、免疫抑制剂使用史。④病史资料不全，或无家属知情同意，或违反伦理学标准。

1.3 实验组亚组分组标准

药物难治组：参考ILAE对耐药性癫痫的定义［7］，达到以下条件后1年内仍有大于1次以上的癫痫发作的患者：①至少经2种抗癫痫药物单药或联合治疗，且每种药物达有效治疗剂量后至少使用1年（具体用药情况详见表1）。②药物使用需达到有效治疗剂量：达到有效血药浓度或说明书最大可耐受剂量。③依据患者癫痫发作类型选用正确的抗癫痫药物。

表1 药物有效组及药物难治组的用药情况Table 1 Medication of drug-resistant group and drug-effective group

药物有效组：使用抗癫痫药物治疗后至少1年内癫痫发作次数小于等于1次者。

分类不明组：对于不符合药物难治组纳入标准及药物有效组纳入标准的患者，归入分类不明组，其中主要包括：经抗癫痫药物治疗无发作但未满1年者；因抗癫痫治疗药物选用错误、用药未达有效治疗剂量等原因癫痫发作仍未控制者等。

1.4 血清高迁移率族蛋白1与TOLL样受体4的检测

实验组及对照组研究对象各抽取2 mL外周血，室温条件下静置30 min后，持续离心10 min，分离并留取血清，保存至-80℃冰箱内，用于血清HMGB1、TLR4的检测。

利用流式荧光检测技术检测血清中HMGB1水平。实验步骤：准备试剂、样品、标准品，样品用稀释液1：4稀释，微孔板上加入样本、质控品或标准品，依次加入微球液、检测抗体（Millipore品牌生产的抗HMGB1抗体试剂盒）、藻红蛋白标记的链霉亲和素，置入Luminex X-200仪器检测，记录数据，分析MFI结果，计算样品中HMGB1浓度。

采用酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测血清中TLR4水平。实验步骤：准备试剂、样品、标准品，样品用稀释液1：20稀释，96孔板上包被捕获抗体，加入样品或标准品，依次每孔加入酶标抗体（Biomatik品牌生产的TLR4配体试剂盒）、辣根过氧化物酶（HRP）、显色液，避光室温下静置20 min，每孔加入终止液终止反应，放入分光光度计（Ther⁃mo品牌的MULTISKAN FC型酶标仪），450 nm波长下检测，560 nm波长下校正，记录数据，绘制Logis⁃tic曲线，计算样品中TLR4浓度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（Xˉ±s）表示。实验组、对照组TLR4、HMGB1水平的比较采用t检验；实验组亚组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；实验组、对照组TLR4与HMGB1的相关性分析采用pearson相关系数分析；TLR4、HMGB1的影响因素的研究采用相关性分析和多因素方差分析。本研究采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组、对照组比较

实验组血清TLR4、HMGB1的水平高于对照组，tHMGB1=2.66，tTLR4=2.26，P＜0.05，差异有统计学意义（表2）。

表2 实验组、对照组血清TLR4、HMGB1水平的比较Table 2 Comparison of the levels of serum TLR4 and HMGB1 between experimental group and control group

2.2 实验组亚组间比较

药物难治组、药物有效组、分类不明组三个实验组亚组间的血清TLR4、HMGB1水平有差异，FHMGB1=6.01，FTLR4=7.50，P＜0.05，差异有统计学意义。亚组间两两比较发现，药物难治组血清TLR4、HMGB1水平高于药物有效组，PHMGB1=0.001＜0.05，PTLR4=0.010＜0.05，差异有统计学意义；药物难治组与分类不明组、药物有效组与分类不明组的组间差异无统计学意义（表3）。

表3 实验组亚组间血清TLR4、HMGB1水平比较Table 3 Comparison of the levels of serum TLR4 and HMGB1 between experimental subgroups

2.3 高迁移率族蛋白1与TOLL样受体4之间的相关性分析

实验组血清TLR4与HMGB1水平呈正相关线性关系，决定系数R2=0.479，P＜0.05（图1）。

图1 实验组血清TLR4、HMGB1分布散点图Fig.1 Scatter map of the levels of serum TLR4 and HMGB1 of experimental group

2.4 高迁移率族蛋白1与TOLL样受体4的相关因素分析

2.4.1 临床因素的单因素方差分析 实验组血清TLR4、HMGB1水平与性别、年龄、起病年龄、癫痫发作类型、癫痫发作持续时间、脑电图表现等因素无关，与病程时长、癫痫发作频率、药物反应性相关。其中病程时长≥10年的癫痫患者的血清TLR4、HMGB1水平高于病程时长＜10年的患者，FHMGB1=10.30，FTLR4=4.06，P＜0.05，差异有统计学意义；癫痫发作频率≥2次/月的癫痫患者的血清TLR4、HMGB1水平高于发作频率＜2次/月的患者，FHMGB1=7.65，FTLR4=10.18，P＜0.05，差异有统计学意义；药物难治组血清TLR4、HMGB1水平高于药物有效组，P＜0.05，差异有统计学意义（表4）。

表4 影响实验组血清TLR4、HMGB1水平的单因素方差分析Table 4 Univariate analysis of the levels of serum TLR4 and HMGB1 in experimental group ()

表4 影响实验组血清TLR4、HMGB1水平的单因素方差分析Table 4 Univariate analysis of the levels of serum TLR4 and HMGB1 in experimental group ()

1）Mixed seizure：secondarily generalized seizure or several seizure types in one person.

2.4.2 临床因素的多因素方差分析 在实验组血清HMGB1、TLR4水平与癫痫发作频率、病程时长、药物反应性三个因素的多因素方差分析中，癫痫发作频率、药物反应性与血清TLR4水平相关，FSeizurefrequency=4.68，FDrugreactivity=3.80，P＜0.05，差异有统计学意义；癫痫发作频率、病程时长、药物反应性与血清HMGB1水平相关，FSeizurefrequency=6.71，FDurationofdisease=6.55，FDrugreactivity=3.96，P＜0.05，差异有统计学意义（表5-6）。

表5 影响实验组血清TLR4水平的多因素方差分析Table 5 Multivariate analysis of the levels of serum TLR4 in experimental group

表6 影响实验组血清HMGB1水平的多因素方差分析Table 6 Multivariate analysis of the levels of serum HMGB1 in experimental group

3 讨论

TOLL样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类表达于免疫细胞及部分非免疫细胞膜上的天然免疫受体，TLR4是Toll样受体家族的其中一员，在神经系统中主要表达于小胶质细胞、星形胶质细胞等。HMGB1是TLR4的内源性配体之一，其在正常情况下，广泛存在于神经系统、心、肝、脾、肺、肾等组织细胞核中，参与DNA转录、翻译和修复。

动物癫痫模型中发现，HMGB1在癫痫发作时，从细胞核释放到细胞外，胞外游离的HMGB1经氧化成为具有活性的二硫键HMGB1，可特异性结合膜受体TLR4或晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation end-product，RAGE），启动炎症级联反应，促进癫痫发生发展［2］。癫痫患者血清中的HMGB1、TLR4水平显著高于非癫痫患者，提示HMGB1、TLR4在人体中同样与癫痫密切相关。

本研究对癫痫患者血清TLR4、HMGB1水平进行相关因素分析，在单因素分析中，我们发现癫痫患者血清TLR4、HMGB1水平与性别、年龄、起病年龄、癫痫发作类型、癫痫发作持续时间、脑电图表现等因素无关，与癫痫发作频率、病程时长、药物反应性相关，癫痫发作频率≥2次/月的患者血清TLR4与HMGB1水平显著高于发作频率＜2次/月的患者，病程时长≥10年的患者血清TLR4与HMGB1水平显著高于病程时长＜10年的患者，IE患者中的血清TLR4与HMGB1水平显著高于非IE患者。在多因素分析中，癫痫发作频率、药物反应性与血清TLR4、HMGB1水平均显著相关，但病程时长与血清HMGB1水平显著相关、与TLR4无相关性。

癫痫患者血清TLR4、HMGB1高于非癫痫患者，且癫痫发作频率≥2次/月的患者血清TLR4、HMGB1水平高于发作频率＜2次/月的患者，提示癫痫发作频率与血清TLR4、HMGB1水平可能呈正相关关系。一方面，HMGB1、TLR4水平升高可诱导癫痫发作，Maroso等［8］发现，向小鼠癫痫模型的侧脑室注射HMBG1，可加速急性癫痫的发作、增加癫痫发作的数量和严重程度，而使用HMGB1、TLR4拮抗剂可抑制小鼠癫痫模型的癫痫发作。另一方面，癫痫发作本身可诱导HMGB1、TLR4水平的升高，有研究者发现使用海人酸（KA）诱导小鼠癫痫发作，1-3 h后海马区HMGB1、TLR4表达增多［8］，运用免疫组化技术对HMGB1进行细胞内定位，可观察到癫痫发作后HMGB1从细胞核移位到细胞质、释放到细胞外的过程［9］。因此，HMGB1、TLR4水平升高可促进癫痫发作，而反复的癫痫发作又促使HMGB1、TLR4水平升高，HMGB1、TLR4水平升高与癫痫发作增加之间可能存在相互促进的关系，形成癫痫发展的恶性循环。

HMGB1、TLR4促癫痫作用的具体病理机制尚未完全明确，本研究中癫痫患者血清HMGB1、TLR4水平升高，且二者之间具有正相关线性关系，提示HMGB1、TLR4在促癫痫过程中可能具有协同作用。研究发现［8，10］，向小鼠癫痫模型的侧脑室注射HMBG1可出现促癫痫作用，而向C3H/HeJ小鼠癫痫模型（T L R4基因变异失活的小鼠）注射HMGB1，未出现HMGB1的促癫痫作用。结合以上研究结果分析，癫痫患者中的HMGB1可能通过激活TLR4发挥促癫痫作用。HMGB1-TLR4通路激活、启动炎症级联反应后主要通过以下途径介导癫痫发生发展：①调节离子通道，改变神经元兴奋性，HMGB1-TLR4通路激活可促进N-甲基-d-天冬氨酸受体（NMDAR）的NR2B亚基的磷酸化，增强了NMDA诱导的神经元细胞Ca2+内流，提高神经细胞的兴奋毒性［11］；②促进炎症因子的分泌，如白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等，而IL-1β、TNF-α等已有研究证明其具有促癫痫作用［1］；③调控相关基因的转录及蛋白的表达，比如HMGB1的增加可下调谷氨酸脱羧酶67（GAD67）和谷氨酸脱氢酶（GLUD1/2）的表达，增加细胞内谷氨酸浓度和主要组织相容性复合体Ⅱ（MHCⅡ）的水平，从而改变神经细胞兴奋性［9］；上调脑内P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达［12-13］，增加对AEDs的抵抗性、参与IE的形成；④损伤血脑屏障（Blood Brain Barrier，BBB），受损的BBB无法拦截外周血中活化的淋巴细胞、抗体、炎症因子、白蛋白、免疫球蛋白等物质进入中枢，加重脑内炎症反应，促进癫痫发作［14-16］。

病程时长≥10年的癫痫患者的血清HMGB1水平高于病程时长＜10年的患者，提示HMGB1水平可能与癫痫慢性病程相关。癫痫患者脑内持续存在的慢性炎症环境可能是癫痫的病理生理基础，HMGB1可能作为重要炎症介质促进癫痫慢性病理损伤，据研究，HMGB1与神经元程序性死亡、认知功能障碍相关，HMGB1可诱导大鼠海马CA1区神经元线粒体发生变构、并启动细胞凋亡，影响大鼠的学习能力、记忆能力［17-18］。本研究发现病程时长与血清HMGB1显著相关，但与TLR4水平不相关，这可能提示HMGB1并不完全依赖TLR4起促癫痫作用，HMGB1除激活TLR4启动炎症反应，也可激活RAGE/NF-κB通路［10，13，19］，HMGB1-TLR4通路并非HMGB1发挥促癫痫作用的唯一途径。另外，研究纳入样本量不足、存在影响血清HMGB1、TLR4水平的未知且未控制的混杂因素，也同样可能导致以上实验结果的产生。

本研究发现IE患者血清HMGB1、TLR4水平显著高于非IE患者，提示HMGB1、TLR4可能增加癫痫患者对AEDs的抵抗性。HMGB1-TLR4通路可能通过调节脑内P-gp的表达参与IE的形成［12］：大鼠癫痫模型中的HMGB1及P-gp水平显著增加，而额外地注射HMGB1可使P-gp表达进一步上调，使用HMGB1拮抗剂预处理后P-gp的表达则取消了上调。依据IE发生机制的转运体假说，AEDs耐药性产生是因为大脑中的AEDs外排转运体异常过量表达，使AEDs在BBB渗透不足或过量外排，中枢神经系统AEDs有效血药浓度不足，癫痫发作难以控制。P-gp是大脑中一种常见的外排转运蛋白，P-gp表达增加被认为与IE密切相关［20］。

综上，HMGB1、TLR4作为免疫应答和炎症反应中的重要炎症标记物与癫痫密切相关，HMGB1、TLR4可能增加癫痫患者对AEDs的抵抗性；癫痫发作频率、病程时长可影响HMGB1的表达，癫痫发作频率可影响TLR4的表达。但本研究样本量较小，未检测IL-1β、TNF-α等下游炎症因子，未排除不同药物类型对HMGB1、TLR4的影响，HMGB1、TLR4在癫痫中的作用仍需要进一步的探究。