黏菌素细菌药物敏感性检测方法学评价

黄 丽， 胡付品， 朱德妹， 郭 燕， 郑永贵 ， 杨 洋， 韩仁如， 张 宏， 黄德喜

黏菌素是阳离子多肽类杀菌剂，主要与细胞外膜上的脂多糖结合，从而破坏细菌的脂多糖结构导致细菌死亡[1]。由于黏菌素存在肾毒性和神经毒性，一度被临床停用。但近年来多重耐药甚至全耐药革兰阴性杆菌的流行播散，为临床的抗感染治疗带来巨大的挑战。多黏菌素类抗菌药物作为治疗耐药革兰阴性杆菌所致感染的有效药物之一，老药新用以挽救耐药革兰阴性杆菌感染患者的生命。

由于多黏菌素类药物分子量较大，在琼脂中不易扩散，导致扩散方法的准确性较差[2]。2016年欧洲抗菌药物敏感性试验委员会/美国临床和实验室标准化协会（EUCAST/CLSI）发表联合声明，不建议采用琼脂稀释法、纸片扩散法和梯度扩散法进行多黏菌素药物敏感性试验[3]。CLSI和EUCAST建议肉汤微量稀释法（BMD）是唯一有效的测试方法[4]，但这种方法操作复杂，成本较高，在大多数临床实验室很难常规开展。2020年CLSI推荐黏菌素肉汤纸片洗脱法（CBDE）和黏菌素琼脂试验（CAT）可作为检测肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌复合菌群对黏菌素的敏感性试验[5]。为了解这两种方法与标准BMD的一致性，本研究对临床分离的486株非重复菌株进行方法学比较，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细菌收集 2019年1月—2020年6月安徽省铜陵市立医院临床分离的非重复菌株486株，包括肠杆菌目细菌277株、铜绿假单胞菌105株和鲍曼不动杆菌104株；肠杆菌目细菌中大肠埃希菌104株、肺炎克雷伯菌125株和其他肠杆菌目细菌48株。药敏试验质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 25922和大肠埃希菌mcr-1阳性株（黏菌素MIC=4 mg/L）[6]。

1.1.2 培养基和抗菌药物 CAMHB肉汤为BD公司产品，黏菌素（colistin）标准品（批号130327-200906， 效价22 740 U/mg）为中国食品药品生物检定所产品，黏菌素纸片（10 μg/片）为OXOID公司产品，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 BMD测试 按照CLSI M23[7]、M07[8]中规定配制操作。

1.2.2 CBDE[5]和CAT[5]根据CLSI M100-S30 文件推荐操作进行。

1.2.3mcr-1基因检测 参照相关文献[9]采用煮沸法提取细菌DNA模板，PCR方法检测mcr-1基因，所用引物按参考文献[10]方法合成。

1.3 评判标准

使用所比较方法的最小范围，将黏菌素MIC结果截短至相同的浓度范围进行方法比较[11]。评估方法学指标[7]为基本一致率（EA）（MIC相差±1稀释度）、分类一致率（CA）、重大误差（ME）和非常重大误差（VME）。如果EA≥90%、CA≥90%，ME≤3%，VME≤1.5%，则认为结果可以接受。

2 结果

2.1 细菌对黏菌素的敏感性

486株细菌药敏试验结果显示，黏菌素对肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌具有高度抗菌活性，细菌耐药率分别为6.5%～6.9%、3.8%和1.0%～1.9%。见表1。486株临床分离株经3种方法测定，结果示黏菌素对23株细菌的MIC值均＞4 mg/L，其中阴沟肠杆菌8株、肺炎克雷伯菌5株、大肠埃希菌4株、铜绿假单胞菌4株、产气克雷伯菌1株和鲍曼不动杆菌1株，按CLSI相关黏菌素耐药（R）的折点标准≥4 mg/L均可判断为对黏菌素耐药。PCR检测质粒介导黏菌素耐药基因mcr-1结果显示，所有耐药细菌均为阴性（数据未罗列）。

表1 三种方法测定细菌对黏菌素的敏感性Table1 Susceptibility of clinical isolates to colistin determined by three methods

2.2 CBDE测定细菌对黏菌素的敏感性

采用CBDE检测486株细菌对黏菌素的耐药性，共检出25株细菌MIC值≥4 mg/L，包括19株肠杆菌目细菌、4株铜绿假单胞菌和2株鲍曼不动杆菌。经BMD测定MIC=1 mg/L的1株肺炎克雷伯菌和1株MIC=0.5 mg/L鲍曼不动杆菌，CBDE检测的MIC值均≥4 mg/L，重复检测后2株细菌结果均无改变。见图1。

图1 黏菌素肉汤纸片洗脱法Figure 1 Colistin broth disk elution method

2.3 CAT测定细菌对黏菌素的敏感性

采用CAT方法检测486株细菌对黏菌素耐药性，共检出24株细菌MIC值≥4 mg/L，包括19株肠杆菌目细菌、4株铜绿假单胞菌和1株鲍曼不动杆菌。与上述CBDE相同的1株肺炎克雷伯菌，BMD测定为MIC=1 mg/L，CAT检测为4 mg/L，重复检测后MIC值没有改变。见图2。

图2 黏菌素琼脂试验Figure 2 Colistin agar test method

2.4 三种方法检测结果一致性比较

2.4.1 CBDE与BMD比较 与BMD结果相比，CBDE测定肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对黏菌素的敏感性，EA分别为90.3%、96.2%和87.5%；CA分 别 为99.6%、100%和99.0%；ME分别为0.4%、0和1.0%；VME均为0。共有13株鲍曼不动杆菌BMD 的MIC值与CBDE的MIC值相差大于±1稀释度。见图3和表2。

图3 CBDE和BMD测定肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对黏菌素敏感性的散点图Figure 3 Scatter plot for determining the sensitivity of Enterobacterales, P. aeruginosa and A. baumannii to colistin by CBDE and BMD

2.4.2 CAT与BMD比较 与BMD结果相比，CAT测定肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对黏菌素的敏感性，EA分别为96.8%、93.3%和99.0%；肠杆菌目细菌CA为99.6%、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌CA均为100%；肠杆菌目细菌ME为0.4%、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌ME均为0；VME均为0。见表2和图4。

表2 CBDE、CAT与BMD检测黏菌素敏感性结果一致性比较Table 2 Consistency of the results of colistin susceptibility tested by CBDE and CAT with reference to BMD

图4 CAT和BMD测定肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对黏菌素敏感性的散点图Figure 4 Scatter plot for determining the sensitivity of Enterobacterales, P. aeruginosa and A. baumannii to colistin by CAT and BMD

表2显示与BMD比较，CBDE和CAT检测肠杆菌目细菌和铜绿假单胞菌对黏菌素敏感性的EA和CA均＞90%，ME均＜3%，VME均为0，具有较高的一致性；而对于鲍曼不动杆菌，CBDE与BMD比较，EA为87.5%，低于90%的可接受率，因此还需要更多的临床数据进一步验证探究。

3 讨论

随着碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌在世界范围内广泛传播，缺乏安全有效的药物治疗和相关感染导致的高死亡率是威胁全球公共卫生的关键因素[12-14]。碳青霉烯类耐药革兰阴性杆菌的高耐药率促使了多黏菌素重新启用，因有着突出且不可替代的作用，多黏菌素成为治疗此类耐药菌株的最后一道防线[15]。2019年CHINET显示[16]，肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对黏菌素具有高度敏感率，耐药率仅为4.3%、1.1%和0.5%。由于多黏菌素存在肾毒性和中枢神经毒性、极窄的治疗指数以及药动学/药效学等问题导致临床该类药物使用受限[17]，因此提供准确的药敏试验结果对于临床抗感染治疗有重要价值。

尽管多黏菌素在临床使用了这么长的时间，但有效性测试的最佳方法仍然不确定。BMD是药敏试验金标准方法，是由CLSI和EUCAST推荐的唯一方法[4]。然而，在临床微生物实验室BMD法作为常规开展检测临床分离株的药敏试验相比较纸片法、商品化药敏测定仪等，则较为繁琐复杂。多黏菌素在琼脂中扩散缓慢，抑制区域小，与参考方法相比，错误敏感率可高达35%[18]。也有文献报道E试验检测方法低估了多黏菌素耐药菌株的耐药水平（MIC≥4 mg/L），高估了易感菌株的MIC值（MIC＜4 mg/L）[19]。因此基于琼脂扩散的纸片扩散法、E试验法因较低的灵敏度，不适用于多黏菌素抗菌活性的测定[20-22]。仪器方法操作简单，药敏测试的时间缩短，但是在VITEK 2系统检测黏菌素耐药革兰阴性菌时灵敏度较低[21]，而Phoenix自动化微生物系统，则发现了较高的假敏感性结果（15%）[17]。

为了寻找一种与BMD同样精确、操作简单且更适合临床实验室开展的黏菌素药敏试验，CLSI经过多中心评估[23]，认定CBDE和CAT检测黏菌素抗菌活性与BMD具有高度一致性，因此2020年1月CLSI推荐这两种方法作为检测肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌复合菌群黏菌素敏感性的试验[5]。

本研究中，我们对277株肠杆菌目细菌、105株铜绿假单胞菌和104株鲍曼不动杆菌进行了CBDE和CAT的检测。以BMD为参考方法，进行方法学比较，以期获得较好的一致性结果。检测结果显示，与BMD检测得的MIC值比较，CBDE测定肠杆菌目细菌和铜绿假单胞菌对黏菌素敏感性的EA和CA均＞90%，ME均＜3%，VME均为0，与BMD具有较高的一致性，验证了CLSI的推荐。对于鲍曼不动杆菌，CBDE与BMD比较，EA为87.5%，低于90%的可接受率，这与CLSI的推荐不符，因此还需要更多的临床数据进一步验证探究。与BMD获得的MIC值比较，CAT测定黏菌素对肠杆菌目细菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌抗菌活性的EA和CA均＞90%，ME均＜3%，VME均为0，与BMD具有较高的一致性，也验证了CLSI的推荐。临床微生物实验室可根据需要选择CBDE或CAT对黏菌素的耐药菌株常规筛查。

质粒携带的mcr基因及亚型是导致细菌对多黏菌素耐药的重要机制 ，全球已经报道的有8种不同质粒携带的基因型mcr-1～mcr-8[24]。本研究中，对检出的23株黏菌素耐药株（肠杆菌目细菌18株、铜绿假单胞菌4株和鲍曼不动杆菌1株），仅选择了耐药基因mcr-1的分子生物学检测，其结果均为阴性。提示耐药菌株可能存在其他还未认识的mcr基因型或还存在目前未能发现的耐药机制[25]，值得进一步的深入研究。

总之，作为向临床推广的两种黏菌素MIC检测的方法，CBDE和CAT都是操作相对简单且价格低廉的方法。CBDE可以购买成品的CAMHB肉汤管，省去试验过程中很多繁琐的步骤。CAT在应用中类似于筛选培养基，但因含有不同药物浓度的黏菌素不能长时间保存。期待有更加简便、实用的药敏试验方法，便于实验室准确检测黏菌素对临床菌株的MIC值，更好服务于临床。