温针灸对兔膝骨性关节炎软骨中Bcl-2和Bax表达的影响

王 铎，刘 娣，马遇原，武永利，3

（1.宁夏医科大学中医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院中医骨伤科，银川750004；3.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，银川750004）

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种软骨细胞代谢异常导致软骨组织损伤，软骨层退变，引发关节功能障碍的疾病。目前研究表明，关节软骨的退变对KOA发病有着重要的影响[1]。关节软骨退变中，细胞凋亡对其病理变化的影响程度最为关键[2]。研究[3]发现，B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和Bcl2-Associated X蛋白质（Bax）分别是Bcl-2家族蛋白中主要的凋亡抑制因子和凋亡促进因子，Bcl-2、Bax两因子之间的相互影响对抑制细胞凋亡作用强弱起重要作用。并在研究中发现，温针灸对于影响软骨细胞的凋亡有着一定的作用[4]。故通过研究软骨细胞中Bcl-2、Bax的表达，可以明确温针灸在治疗KOA过程中对Bcl-2、Bax的影响。本实验通过制备KOA兔模型，并给予温针灸等方法干预，探讨温针灸对KOA兔软骨细胞中Bcl-2、Bax表达的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰雄兔40只，体质量2.5～3.0 kg，由宁夏医科大学实验动物中心提供，批号：SYXK（宁）2015-0001。动物全部分笼饲养于宁夏医科大学动物实验室，标准饲料，自由进食、饮水，并每日密切观察实验兔生存状态。

1.2 实验耗材与试剂

无菌针灸针（华佗牌，苏州医疗用品厂有限公司，规格0.25 mm×25 mm）。清艾条（江苏康美制药有限公司，规格20 cm×2.1 cm，国药准字Z32020253）。改良Lillie-Mayer苏木素染色液（北京雷根生物技术有限公司，产品编号：DH0001）。EDTA脱钙液（北京酷来博科技有限公司，产品编号：SL1 500-500 mL）。多聚甲醛（天津市大茂化学试剂厂，产品编号：3709）。兔Bcl-2抗体（北京博奥森生物技术有限公司，产品编号：bx-0032R）。兔Bax抗体（北京博奥森生物技术有限公司，产品编号：bs-0127R）。兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：PV-9001）。HRP标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，产品编号：ZB-2301）。

1.3 实验方法

1.3.1 KOA模型的制备 将6月龄普通雄性新西兰兔分笼单独适应性饲养5 d后，随机挑选10只作为空白组，余30只予以右后肢伸直位石膏管型固定进行兔KOA造模，后随机分为温针灸组、阿仑膦酸钠组、模型组每组10只；实验共4组。新西兰兔造模后密切观察，一旦发现兔远膝端肿胀、糜烂、石膏脱落及严重撕咬等现象，将该兔剔除，立即重新造模。兔造模2周模拟临床前、中期KOA中老年患者，根据文献持续固定4周后造模完成[5]，造模完成后，并随机抽取2只造模兔进行HE染色验证造模成功。

1.3.2 干预方法 造模完成3 d后，去除石膏，进行干预。温针灸组：参照《实验针灸学》在兔膝关节外侧下缘凹陷处先定位“外膝眼”后参照人体穴位定位“鹤顶”“内膝眼”，放置兔架上予以温针灸，每穴刺入3～5 mm，从上端点燃艾柱，每穴灸3壮，每日1次，每次15 min，由实验人员密切观察，7 d为1个疗程，共治疗4个疗程；阿仑膦酸纳组：使用150 μg·（kg·d）-1阿伦磷酸钠溶液配比蒸馏水进行灌胃，疗程4周；模型组：不予任何干预手段，每天在固定器上固定15 min；空白组：不予造模，不予任何干预手段，每天在固定器上固定15 min。

1.3.3 动物取材 在实验完成1 d内采用空气栓塞法将兔处死，打开兔膝关节腔，充分暴露关节软骨，取右侧胫骨。用生理盐水充分冲洗后放入4%多聚甲醛中进行固定24～48 h后，放入15%EDTA脱钙液（1周更换1次）中，石蜡包埋，后切片，用HE染色法观察软骨形态的变化及免疫组织化学检测软骨细胞中Bcl-2、Bax的表达。1.3.4 HE染色进行Mankin's评分 取石蜡切片依次置于二甲苯Ⅰ液和Ⅱ液、无水乙醇Ⅰ液和Ⅱ液、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇及蒸馏水，再依次置于改良Lillie-Mayer苏木素染色液、盐酸乙醇分化、蒸馏水反蓝、伊红染色液中，冲洗，脱水，透明，封片。用扫描光镜在100、200、400倍光学显微镜下观察软骨结构、软骨细胞、软骨基质的变化，软骨潮线的完整性。依据Mankin's评分标准进行评分[6]，分析软骨损伤情况。

1.3.5 免疫组织化学检测Bcl-2、Bax表达 取切片使用兔二步法检测试剂盒检测后封片，于扫描光镜下选取5个高倍视野进行拍照，利用IPP 6.0图像处理软件进行分析，计算光密度（OD）值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSDt检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组兔胫软骨组织病理改变及Mankin's评分

各组软骨组织HE染色后光镜下显示，空白组软骨滑膜表面完整、光滑，软骨细胞排列正常、细胞核完整、无增生或减少，软骨基质着色正常，潮线结构完整、清晰；模型组软骨表面粗糙、少量缺损、有裂隙，软骨细胞排列紊乱、细胞明显减少，软骨基质着色失染，潮线扭曲；阿仑膦酸钠组软骨表面毛糙、有裂隙延伸至软骨下骨，软骨细胞排列不均匀、细胞数量减少，软骨基质着色较浅，部分区域可见双重潮线；温针灸组软骨表面平整、无明显缺损，细胞排列局部紊乱、数量无减少，软骨基质着色不明显，潮线结构清晰，见图1。Mankin's评分结果，模型组评分高于空白组（P＜0.05）；温针灸组及阿仑膦酸钠组评分低于模型组，温针灸组评分低于阿仑膦酸钠组（P均＜0.05），见表1。

图1 各组兔胫软骨组织损伤状况（HE×200）

表1 各组兔胫软骨组织Mankin′s评分比较（±s）

表1 各组兔胫软骨组织Mankin′s评分比较（±s）

与空白组比较*P＜0.05；与模型组比较△P＜0.05；与阿仑膦酸钠组比较◇P＜0.05。

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2.2 免疫组织化学检测各组兔软骨细胞中Bcl-2、Bax的表达水平比较

Bcl-2、Bax的阳性表达均定位于软骨细胞的细胞质中，显示为黄色或者棕黄色颗粒。空白组软骨细胞中Bcl-2表达明显，着色较深、分布密集，Bax基本无表达；模型组细胞中Bcl-2基本无表达，Bax明显散在细胞质和细胞核中；阿仑膦酸钠组中Bcl-2可见部分表达，着色较浅，Bax表达只见于部分散在软骨表层；温针灸组Bcl-2少见部分表达，颜色变浅，Bax表达散在浅表部位，着色较浅，见图2、图3。与空白组比较，模型组软骨细胞中Bax表达升高；Bcl-2表达降低（P均＜0.05）；与模型组比较，温针灸组和阿仑膦酸钠组中Bcl-2表达升高，Bax表达下降（P均＜0.05）；温针灸组与阿伦磷酸钠组Bcl-2、Bax表达无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图2 各组兔软骨细胞Bcl-2表达（免疫组化×200）

图3 各组兔软骨细胞Bax表达（免疫组化×200）

表2 各组软骨细胞中Bcl-2、Bax表达比较（±s）

表2 各组软骨细胞中Bcl-2、Bax表达比较（±s）

与空白组比较*P＜0.05；与模型组比较△P＜0.05。

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3 讨论

KOA是各种原因引起关节软骨出现原发性或继发性病理改变，致使关节出现疼痛、屈伸、活动不利等症状，从而影响膝关节功能的一种退行性疾病[7]。中医学认为，KOA属于中医“痹症”的范畴，《素问·痹论》中提出“风寒湿三气杂至，合而为痹”的观点[8]，其主要病证型为风寒湿滞证，治法应当散寒祛湿、温阳补虚。温针灸是针刺和艾灸相结合的一种治疗手段，针刺的同时施予艾灸，既加强了针刺的刺激强度，又使艾灸的温热效应得到很好的传递，能够达到良好祛风散寒除湿效果[9]。所以采用温针灸治疗KOA有着独特的优势。在临床上，温针灸治疗KOA的疗效也得到了肯定[10]。而现代医学对于温针灸治疗KOA的机制尚未明确，只是近些年研究发现，软骨细胞凋亡对于关节软骨的损伤起着重要的作用[11]。

KOA发生、发展的主要病理变化是关节软骨退变，关节软骨的主要组成是软骨细胞和细胞外基质。软骨细胞的凋亡，是影响软骨退变的重要因素[12]。所以，保证软骨细胞的生存是防治KOA的重点。Bcl-2家族是调控细胞凋亡的主要蛋白，主要分为促凋亡蛋白（Bid、Bim等）、促凋亡效应蛋白（Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-x等）。研究表明[13-15]，Bcl-2与Bax通常以异源二聚体的形式存在，共同调节细胞凋亡，当Bcl-2表达高时，与Bax形成异源二聚体，抑制Bax形成，延缓细胞凋亡；Bax表达高时，形成Bax同源二聚体，诱发Cyt-C释放，活化Caspase-9，使Caspase-9酶切Caspase-3酶原，激活Caspase-3，促使Caspase-3剪切，诱发细胞凋亡。Bcl-2和Bax两种蛋白，在正常情况下以适当比例存在，共同参与细胞生理过程，在细胞凋亡发生时，二者的比例发生变化，使线粒体膜通透性增加，激活Caspase家族蛋白，致使凋亡加速发生[16]。研究[17]表明，Bcl-2在BCL-2家族中抗凋亡能力最强，Bax是主要的促凋亡因子。所以，Bcl-2和Bax的生成在KOA的发展进程中起着至关重要的作用。

本研究结果显示，温针灸及阿仑膦酸钠干预后，KOA兔关节软骨表面平整、细胞排列有序、细胞数目增多、Mankin's评分降低，表明温针灸组与阿仑膦酸钠组均可改善KOA软骨损伤程度，对于治疗KOA有着明显的作用。通过免疫组化测量结果发现温针灸及阿仑膦酸钠治疗KOA兔可引起Bcl-2及Bax表达发生变化，表明温针灸与阿伦磷酸钠均能在KOA发展过程中对Bcl-2、Bax表达产生影响，说明温针灸可通过调控Bcl-2和Bax在软骨细胞中的表达来阻止细胞凋亡的发生。此结果与王舰等[18]研究结果一致，证明温针灸通过上调Bcl-2、下调Bax来抑制软骨细胞凋亡，从而延缓KOA的发展进程。在KOA进程中调节Bcl-2、Bax表达可调控软骨细胞凋亡水平，促进软骨细胞修复和再生，以维持软骨细胞的正常生存状态，最终达到治疗KOA的目的。

综上所述，温针灸能够影响细胞凋亡在KOA进程中的发生，并有效地增强Bcl-2、抑制Bax在KOA中的表达，由此得出结论：温针灸治疗KOA的作用机制在于调控Bcl-2、Bax的表达来影响软骨细胞的凋亡。在本课题组进一步探讨的过程中，也发现了细胞凋亡与细胞自噬的发生有着密切的联系，但其作用机制还尚未明确，故本实验组将进一步探讨温针灸对细胞“自噬—凋亡”在KOA中的作用机制。