番石榴叶中挥发油组分的固相微萃取分析

许亦真

(齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省分析测试中心, 山东 济南 250014)

番石榴(PsidiumguajavaL.)是一种适应性非常强的热带果树，又称那拔、番桃树等，属桃金娘科[1]。该果树原产于南美洲，在中国华南地区亦有大面积的人工培植或野生品种。番石榴果实可供鲜食，番石榴叶含有挥发油及结构比较复杂的多元酚类化合物等，可作为中药使用，有消除痢疾、止血、清热、健脾胃等功效[2-3]。番石榴叶经煮沸后可去掉单宁等鞣酸组分，将其晒干后，可制作成茶叶，味甘，有清热之效。大量临床试验结果表明[4-8]，番石榴叶具有显著的降糖降压、抗氧化、抗菌等功效，同时含有多种维生素以及矿物质元素。其中，傅予等[6]对番石榴叶中总黄酮的提取工艺进行了优化研究，并以小鼠为模型，考察了番石榴叶的降糖特性，验证了其对维持糖尿病小鼠正常血糖水平的积极效应。

目前，对于番石榴果实中化学组分的研究相对比较全面，但对于叶中化学组分的研究及其作为中药等的药代动力学研究相对较少。已有研究证明番石榴叶药理活性显著，其中没食子酸等酚酸类、黄酮类、三萜酸、倍半萜类等物质具有极强的抗氧化和抗炎作用，同时具有一定降糖作用[9-11]。因此，对番石榴叶中挥发油组分的定性分析具有重要意义，可以为其作为中药的开发利用提供重要的数据支持[12-13]。

Arthur等[14]提出的固相微萃取技术(solid phase microextraction, SPME)，最初主要用于分析环境中的有机污染物，后来经过发展，在食品、药品等领域得到了广泛的应用。该技术集采样、萃取、浓缩和进样于一体，操作简单且高效，富集效果优异。白丽丽等[15]采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术分析了番石榴果实中的挥发性组分，并采用面积归一化法计算了各组分的相对含量。本研究采用固相微萃取-气相色谱质谱联用技术，对番石榴叶中挥发油组分进行分析鉴定，并通过单因素试验对固相微萃取的条件进行了优化。

1 仪器与材料

Agilent 7890A-5973N气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)，MS105型微量分析天平(Mettler Toledo仪器公司)，100～1000 μL移液器(编号429358A，德国Eppendorf公司)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，HH-420 恒温水浴锅(上海一科仪器有限公司)，Millipore超纯水系统(美国Merck Millipore公司)，SPME手动进样手柄、碳分子筛羧乙基/二乙烯基苯/聚二甲基硅氧烷(CAR /DVB/PDMS)(50 μm)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯PDMS/DVB(65 μm)、聚丙烯酸酯PA(85 μm)、聚二甲基硅氧烷PDMS (100 μm)固相微纤维(美国Superlco公司)。

番石榴叶样品，2018年采集于云南省玉林市，经过洗涤、晾晒、粉碎并过20目金属网筛，备用；正己烷、甲醇(色谱纯、国药集团化学试剂有限公司)；氯化钠(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

2 方法与条件

2.1 样品处理

番石榴叶样品经过粉碎，过20目金属网筛，称取1.0 g待测粉末样品置于20 mL顶空瓶中，加入5 mL超纯水，密封并压盖。顶空固相微萃取温度为70 ℃，时间为40 min，解析时间为5 min。

2.2 气相色谱分析

目标化合物通过Agilent DB-5 ms(30 m×250 μm,0.5 μm)色谱柱进行分离，升温程序为：初始温度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/ min升至140 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升至280 ℃保持10 min。进样口温度280 ℃。采用不分流进样模式。载气为高纯氦气，流速为1.0 mL/min。

采用NIST 2017数据库进行化合物的鉴定。离子源为电子电离源(EI)，电离能量为70 eV，温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，传输线温度为300 ℃。扫描模式为全扫描，范围29～600m/z。

固相微萃取纤维老化与空白试验：将固相微萃取纤维插入气相色谱进样口中老化，进样口温度设定为各固相微萃取纤维的最高耐受温度以下10 ℃，直至没有杂质峰被检测出来。取5 mL超纯水，加入适当氯化钠，配置成空白对照溶液，对空白对照溶液进行顶空分析，色谱图为空白对照谱图。

2.3 萃取条件优化试验设计

选取对萃取效果有明显影响的因素进行单因素试验，以总出峰数目及总峰面积为因变量，对各因素进行优化。各试验参数设计如下：(1) 固相微萃取纤维为CAR/DVB/PDMS (50 μm)、PDMS (100 μm)、PDMS/DVB (65 μm)、PA (85 μm)；(2) 萃取温度 20、35、50、65、80 ℃；(3) 萃取时间 10、20、30、40、50 min；(4) 样品溶液的离子强度 (氯化钠的质量分数) 0、5%、10%、15%、20%、25%、30%。

3 结果与讨论

3.1 固相微萃取纤维的选择

分别对Superlco的4种不同的萃取纤维进行对比，以每种萃取纤维提取出来的目标峰数目为依据，对其萃取能力进行评价分析。其他萃取条件分别为：萃取温度80 ℃，萃取时间50 min，样品溶液的离子强度为0。结果见图1。CAR/DVB/PDMS混合涂层的固相微萃取纤维能够提取出69种化合物，PDMS/DVB、PDMS分别提取出了60和44种化合物，而PA涂层的固相微萃取纤维仅能够提取29种化合物。因此，采用CAR/DVB/PDMS固相微萃取纤维对番石榴叶中的挥发油物质进行提取。

图1 固相微萃取纤维对萃取效率的影响Fig.1 Effects of sorbents of SPME fiber on the extraction efficiency

3.2 萃取温度的优化

提高萃取温度有利于植物组织中挥发性组分挥发至顶层空气中，对萃取过程有积极影响。其他萃取条件分别为：萃取涂层为CAR/DVB/PDMS，萃取时间50 min，样品溶液的离子强度为0。通过图2可以看出，温度从20～80 ℃的递增过程中，提取的总化合物个数和总峰面积均在不断增长。考虑到温度提升至80 ℃，对萃取效率的提升没有太多积极影响，反而温度过高容易导致某些物质产生化学变化。因此，本试验中以65 ℃作为最优萃取温度。

图2 固相微萃取温度对萃取效率的影响Fig.2 Effects of sorbents of SPME extraction temperature on the extraction efficiency

3.3 萃取时间的优化

由于萃取时间的改变对提取目标物个数的影响没有对总峰面积的影响大，因此，以总峰个数和总峰面积的变化为依据，选择最优的萃取时间。其他萃取条件分别为：萃取涂层为CAR/DVB/PDMS，萃取温度65 ℃，样品溶液的离子强度为0。从图3中可以看出，随着萃取时间的不断增长，总峰面积和总峰个数也随之不断增加，并在40 min的时候达到最高。故选择40 min作为最优萃取时间。

图3 固相微萃取时间对萃取效率的影响Fig.3 Effects of sorbents of SPME extraction time on the extraction efficiency

3.4 离子强度的优化

由于盐析效应的存在，特定情况下加入一定量的无机盐能够促进一些物质从溶液中分离出来或者挥发出来。本试验采用氯化钠作为盐析剂，并以总峰个数和总峰面积的变化为依据来选择最优的盐析剂加入量。其他萃取条件分别为：萃取涂层为CAR/DVB/PDMS，萃取温度65 ℃，萃取时间40 min。从图4中可以看出，在样品溶液的离子强度(氯化钠质量分数)为20%的条件下，结果最优。

图4 固相微萃取离子强度对萃取效率的影响Fig.4 Effects of sorbents of SPME ionic strength on the extraction efficiency

通过优化试验得出最优的试验条件为：CAR/DVB/PDMS萃取纤维；萃取温度65 ℃；萃取时间40 min；离子强度20%。

3.5 挥发油组分分析

通过GC/MS分析，最多可以分离出70个色谱峰，其中能够通过美国国家标准与技术研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)谱库鉴定出化合物结构的有47个，其相对含量占总挥发油组分含量的93.93%。色谱图以及鉴定出的化合物分别见图5和表1。

表1 番石榴叶中挥发油组分及含量

续表1

图5 番石榴叶挥发油组分总离子流图Fig.5 The total ion chromatogram of volatile compounds in guava leaves

经过NIST谱库分析，鉴定出的47种化合物中麦芽酚的含量相对较高，占总挥发性及半挥发性组分含量的10.65%。相对含量较高的化合物有二氢猕猴桃内酯(7.69%)、石竹烯(6.06%)、植酮(5.39%)、1-(4-叔丁基苯基)丙-2-酮(4.36%)、咕吧烯(4.00%)、芳樟醇(3.42%)、棕榈酸甲酯(3.14%)、α-紫罗兰酮(3.08%)以及2-十三碳烯醛(3.06%)。根据化合物基团的不同进行统计，其中酮类化合物有8种，其相对含量最高，占总含量的18.82%；醛类化合物共有14种，占总含量的17.95%；酯类化合物共有5种，占总含量的14.41%；醇类化合物共有6种，占总含量的11.37%；烯烃类化合物共有4种，占总含量的13.43%，酸类化合物共有2种，占总含量的1.58%；剩余酚类等其他化合物共有8种，占总含量的16.41%。

4 结语

本研究通过固相微萃取-气相色谱质谱法提取了番石榴叶中的挥发油组分，共鉴定出47种有机化合物，占总挥发油组分含量的93.95%。鉴定出的主要组分有麦芽酚、二氢猕猴桃内酯、石竹烯、植酮、1-(4-叔丁基苯基)丙-2-酮、咕吧烯、芳樟醇、棕榈酸甲酯、α-紫罗兰酮和2-十三碳烯醛，其相对含量均大于3%。鉴定出来的酮类化合物有8种，其相对含量最高，占18.82%；其余依次为醛类 (17.95%)、酯类 (14.41%)、烯烃类(13.43%)、醇类 (11.37%)、酸类 (1.58%)和酚类 (10.65%)。其他类化合物共有8种，占总含量的16.41%。其中，多种化合物具有一定的降糖、降血压等药用价值。综上所述，该方法对番石榴叶中挥发油组分的分析效果良好，可为番石榴叶药用价值的研究提供方法及数据支持。