肺癌侵袭转移与外周血RASSF1A、SHOX2甲基化水平的相关性研究

唐华 唐际富 廖洪春 岑玉兰 廖光付

肺癌是一种源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，是世界范围内发病率和病死率较高的恶性肿瘤，严重威胁人类的生命健康[1]。随着近年来医疗水平的发展，尽管肺癌的治疗方法有着很大改进，但其存活率仍无法明显提高，而导致肺癌患者死亡的最主要原因是恶性肿瘤的侵袭和转移[2]。因此，寻找与肺癌侵袭转移相关的分子生物学标记物，可能对改善肺癌预后有重要意义。Ras相关区域家族蛋白1A(Ras-association domain family 1A，RASSF1A)与多种恶性肿瘤的发生发展有密切联系，是一种新型的抑癌基因，且RASSF1A是肿瘤中甲基化程度最高、最普遍的基因之一[3]。矮小同源盒基因2(short stature homobox 2，SHOX2)是同源盒基因家族的一员，可调控基因的表达和控制器官发生及细胞分化。研究表明，SHOX2是肺癌诊断时研究较多的甲基化指标[4]。已有肺泡灌洗液中RASSF1A、SHOX2基因甲基化检测在肺癌诊断中的研究[5]，但关于外周血中二者甲基化水平与肺癌侵袭转移相关性的研究较少。因此，本研究通过探讨RASSF1A、SHOX2基因甲基化与肺癌侵袭转移的关系，以期为肺癌基因治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年2月至2017年5月于广西科技大学第二附属医院就诊的96例肺癌患者为肺癌组(经组织病理学确诊)，其中男59例，女37例；年龄46～73岁，平均年龄(59.97±10.48)岁。同期选取114例健康体检者作为对照组，其中男70例，女44例；年龄48～76岁，平均年龄(60.84±10.56)岁。2组年龄、性别比差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，均由专业人员详细告知所有受试者研究内容，并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①经影像学检查、临床特征及病理证实确诊为肺癌患者，肺癌患者符合诊疗规范[6]；②病历资料齐全者；③年龄>18岁者；④术前未接受过放疗、化疗等辅助治疗。

1.2.2 排除标准：①合并其他感染性疾病、严重肝功能异常或肾功能异常者；②有其他恶性肿瘤或恶性肿瘤史者；③有严重认知功能障碍或精神障碍者；④已参与其他临床试验或因其他原因不能参与试验者。

1.3 主要试剂与仪器 DNA提取试剂盒(货号：JL1545)，购自德国QIAGEN公司；CpGenome DNA Modification Kit(货号：XY-S7821)，购自德国Merck Millipore公司；PTG19-T载体(货号：WH0194-GDH)，购自北京百奥莱博科技有限公司；XL-10 Gold感受态细胞(货号：KL1152)，购自上海康朗生物科技有限公司。PCR仪(型号：T100)，购自美国Bio-Rad公司。

1.4 研究方法

1.4.1 样品采集及保存:对照组于体检当天、肺癌患者于入院第2天采集清晨空腹外周静脉血样，加入乙二胺四乙酸二钾充分抗凝，3 000 r/min离心15 min后收集血浆，置于-80℃保存待测。

1.4.2 血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平测定:亚硫酸氢钠处理基因组DNA后采用直接测序法检测RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平。DNA抽提试剂盒提取血浆基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度，-20℃保存。采用亚硫酸氢钠修饰试剂盒对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。RASSF1A、SHOX2引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR扩增条件：95℃预变性6 min；94℃ 15 s，55℃ 30 s，75℃ 40 s，40个循环。PCR反应体系共50 μl：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，2×PCR Mix 25 μl，ddH2O 21 μl。目标片段割胶回收后连接，采用PTG19-T做载体，XL-10 Gold感受态进行转化、复苏、涂板，酶切法鉴定阳性菌落，上海生工生物工程股份有限公司测序，甲基化数据用BIQ Analyzer软件分析和整理。见表1。

表1 PCR引物序列

1.5 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件，计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验，采用多因素COX回归分析影响肺癌预后的因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化阳性率比较 肺癌组血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化阳性率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化阳性率比较 例(%)

2.2 肺癌患者血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化与临床病理特征的关系 根据是否发生RASSF1A、SHOX2

基因甲基化，将96例肺癌患者分为RASSF1A非甲基化组38例，RASSF1A甲基化组58例；SHOX2非甲基化组34例，SHOX2甲基化组62例。RASSF1A、SHOX2基因甲基化与肺癌患者年龄、性别、吸烟情况、肿瘤大小、病理类型无关(P>0.05)，与肺癌患者组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)。见表3。

表3 肺癌患者血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化与临床病理特征的关系 例(%)

2.3 肺癌患者血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化与预后的关系 随访3年，根据随访期间肺癌患者生存情况，将其分为生存44例和死亡52例。RASSF1A、SHOX2基因甲基化与肺癌患者预后有关(P<0.05)，且RASSF1A、SHOX2甲基化组患者死亡比例高于RASSF1A、SHOX2非甲基化组。见表4。

表4 肺癌患者血浆RASSF1A、SHOX2基因甲基化与预后的关系 例(%)

2.4 影响肺癌预后的多因素COX回归分析 将肺癌患者是否发生死亡作为因变量，以患者血浆SHOX2、RASSF1A基因甲基化、组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期为自变量进行分析，结果显示，RASSF1A、SHOX2基因甲基化、TNM分期是影响肺癌患者死亡的独立危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响肺癌预后的多因素COX回归分析

3 讨论

近年来，肺癌发病率呈上升趋势，且趋于年轻化，研究表明，绝大多数肺癌患者确诊时已到癌症中晚期，尤其对于确诊时已发生远处转移且不能切除的肺癌患者，其治疗较为困难，导致生存率很低[7]。研究发现，多种肿瘤均存在至少一个基因的启动子发生高甲基化，DNA甲基化已成为肿瘤发生发展机制的研究热点之一[8]。研究表明，肺癌的侵袭和转移与基因启动子甲基化密切相关[9]。

RASSF1A基因作为Ras激活信号通路中的负向调节基因，可能是参与细胞周期调控的重要抑制蛋白，通过多种途径抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老[10]。RASSF1A基因转录水平的表达与肺癌的TNM分期和淋巴结转移存在明显相关性，同时说明RASSF1A基因参与肺癌的发展进程，在其侵袭和转移过程中可能发挥重要调控作用[11]。本研究结果显示，肺癌患者血浆RASSF1A基因甲基化阳性率高于健康人群，与张洪彬等[12,13]研究结果相似，RASSF1A基因甲基化是影响肺癌患者死亡的独立危险因素，且RASSF1A基因出现甲基化的死亡患者比例高于非甲基化。推测RASSF1A基因的特异性甲基化可能导致RASSF1A基因在肺癌中的表达失活，进而使得RASSF1A蛋白无法参与细胞周期的调控，导致肿瘤细胞生长迅速，同时发生肺癌的侵袭和转移，肺癌患者病情加重，死亡概率增加。

研究表明，SHOX2基因甲基化已成为辅助肺癌诊断的生物标志物，其诊断有较高的特异性和敏感度，且在肺癌患者外周血、支气管灌洗液、胸腔积液、肿瘤组织等标本中均能检测到SHOX2基因甲基化[14]。本研究结果中肺癌患者血浆SHOX2基因甲基化阳性率高于健康人群；SHOX2基因甲基化是影响肺癌患者死亡的独立危险因素，且SHOX2基因出现甲基化的死亡患者比例高于非甲基化。提示SHOX2基因甲基化水平可反映病情进展，随着肺癌发生侵袭和转移，恶性程度的增高，SHOX2基因甲基化水平增高，更易检测[15]。此外，本研究结果中RASSF1A、SHOX2基因甲基化与肺癌患者组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期有关。进一步提示RASSF1A、SHOX2甲基化可能参与肺癌的侵袭转移，且基因甲基化可能多发生于有淋巴结转移的低分化肺癌。

综上所述，RASSF1A、SHOX2基因甲基化水平与肺癌的侵袭转移及预后有密切联系，对基因甲基化的研究可能为今后寻找更多的治疗新靶点和肿瘤分子生物学标记物起到积极的推动作用。然而本研究存在一定的不足之处，检测甲基化过程中，采用亚硫酸氢钠处理后，引物与模板发生错配的概率增高，有可能会造成非特异性扩增。有待今后采用更先进的检测技术、纳入更多样本进一步深入探究。