CA125与E-cadherin在复发性流产患者血清与组织中的表达及关系研究

关英霞 蒋蕾 尹洁 马静 史丽

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)目前仍是亟待解决的妇产科难题，因病因错综复杂导致治疗难度增加。大多数专家认为，连续发生2次流产即应重视并予评估，因其再次出现流产的风险与3次者相近，它在育龄期女性中常见[1]。研究表明，RSA已知的主要病因有染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常、免疫功能异常、感染性因素、血栓性因素及外部环境因素等[2]。目前仍有近半数的RSA病因未明确，因此需要更深入地研究复发性流产的发病原因，以期获得合理有效的诊治方案。有研究表明，CA125可作为先兆流产评估、子宫内膜异位症及肿瘤的标记物[3,4]。E-cadherin是参与细胞-细胞间、细胞-基质间粘附作用的细胞因子，其与复发性流产的发病相关[5,6]。本研究旨在探讨CA125与E-cadherin在复发性流产中的表达情况及相互关系，以期获得两者在复发性流产诊断及治疗中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年11月至2019年11月于河北医科大学第四医院妇产科因复发性流产行清宫术的患者50例为试验组，同期正常妊娠行人工流产术的患者50例为对照组。本研究获得了河北医科大学第四医院的伦理委员会批准(伦理号：2016MEC122)。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①研究对象均身体健康，近期未服用激素类药物，无不良生活习惯，无其他遗传病史。②复发性流产组病例纳入标准：≥2次流产史，超声无明显解剖结构异常，此次经B超联合人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)检测确认胚胎发育停止行清宫术，超声结果提示无生殖系统畸形，术后绒毛组织常规行低深度全基因组高通量测序法排除因染色体异常导致流产。③选择同期正常妊娠要求终止的50例为对照组，对照组病例纳入标准：经B超检查胚胎发育正常的健康孕妇，超声结果提示无生殖系统畸形。

1.2.2 排除标准：①生殖道畸形；②合并代谢异常或免疫系统障碍；③术后低深度全基因组高通量测序法验证因染色体异常。

1.3 试剂与仪器 CA125抗体和E-cadherin抗体，Entrez Gene:207，购自博奥森生物技术有限公司(北京，中国)。二抗羊源抗兔抗体，购自博奥森生物技术有限公司(北京，中国)。DAB显色系统购自Sigma公司。

1.4 实验方法

1.4.1 样品预处理:用于血清学检测对象均于术前取空腹肘静脉血3 ml，静置1 h后以1 500 r/min离心取上清，-20℃保存备用。在收集相应的蜕膜组织后经洗涤、脱水、固定等步骤，最后进行常规石蜡包埋制成厚度5～8 μm的标本。

1.4.2 CA125和E-cadherin采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测：实验操作严格按说明书进行，每份标本做两个平行孔，且所有标本均在同一批内检测。采用2960型全自动酶标仪(Metertechinc)测定。

1.4.3 免疫组化检测CA125和E-cadherin的表达:①组织包埋、脱蜡、切片：将预先包埋好的蜕膜组织切片，烤片，二甲苯替代品脱蜡，再用多浓度梯度下降的乙醇溶液水化，蒸馏水洗涤。②组织修复：用柠檬酸缓冲液微波修复抗原，PBS溶液洗涤2次。③抗体孵育：37℃BSA封闭蛋白30 min，滴加一抗4℃过夜孵育，PBS溶液洗涤2次，再滴加对应的二抗37℃，孵育1 h，PBS溶液洗涤2次。DAB显色，苏木素复染，反蓝，脱水，透明，封片。再在Nikon 80i显微镜(日本)下观察结果。

1.4.4 免疫组化评价标准:CA125和E-cadherin蛋白表达水平的阳性结果判读：细胞浆或胞膜上呈现棕黄色，以显微镜下观察阳性细胞百分率和颜色深度进行综合评分，即总体百分率≤10% 为(-)；11%～25%为(+)；26%～50%为(++)；>50%为(+++)。结果由两名具有相关经验的人员进行评分并取均值，差异性大的评分进行2次复核，最终确定其评分。

1.5 观察指标 观察2组患者年龄、体重指数、妊娠时间(d)、血红蛋白数、孕次、产次、痛经、是否辅助生殖。其中痛经依靠患者主诉。询问并查阅患者是否辅助生殖，内容包括人工授精和试管。

2 结果

2.1 复发性流产与临床资料的相关性分析 2组临床资料比较：年龄、体重指数、痛经、辅助生殖差异有统计学意义(P<0.05)；妊娠时间、血红蛋白数、孕次、产次差异无统计学意义(P>0.05)。复发性流产与年龄、体重指数、痛经、辅助生殖相关，与妊娠时间、血红蛋白数、白细胞数、孕次、产次不相关。见表1。

表1 一般临床资料比较 n=50

2.2 CA125、E-cadherin在复发性流产和正常妊娠患者血清中的表达 复发性流产患者血清中CA125表达水平明显高于正常妊娠组，差异有统计学意义(P<0.05)；血清中E-cadherin表达水平在2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 CA125、E-cadherin在正常妊娠和复发性流产患者血清中的表达情况

2.3 CA125在复发性流产和正常妊娠患者蜕膜组织中的表达情况 CA125主要表达于蜕膜细胞浆或胞膜上，呈现棕黄色。在50例复发性流产蜕膜组织中表达水平明显高于正常妊娠组，2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表3，图1。

表3 CA125在正常妊娠和复发性流产蜕膜组织中的表达情况 n=50,例(%)

低表达 中表达 高表达

2.4 E-cadherin在复发性流产和正常妊娠患者蜕膜组织中的表达情况 E-cadherin主要表达于蜕膜细胞浆或胞膜上，呈现棕黄色。在50例复发性流产患者蜕膜组织中的表达水平明显低于正常妊娠组，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图2。

表4 E-cadherin在正常妊娠和复发性流产患者蜕膜组织中的表达情况 n=50,例(%)

低表达 中表达 高表达

2.5 CA125和E-cadherin在复发性流产患者蜕膜组织中表达的相关性分析 CA125在复发性流产蜕膜组织中呈高表达，而E-cadherin呈低表达，两者有明显负相关(r=-0.325，P=0.021)。见图3。

图3 在复发性流产患者蜕膜组织中CA125和E-cadherin的表达水平呈负相关

3 讨论

近年来，复发性流产呈现出了逐年上升的趋势[7]，因其病因错综复杂，目前仍有近50%病例病因未明。本研究所选复发流产病例排除染色体异常及生殖道解剖异常。临床资料结果表明，复发性流产病例的年龄高于对照组，说明除高龄女性所致卵巢功能减退、卵子质量下降易出现胚胎染色体异常外，年龄仍然与复发性流产相关，可能是复发流产的高危因素。而BMI增高是现今大部分复发流产患者所面临的问题，因肥胖会影响内分泌、正常受精、胚胎着床稳定性等。有研究表明，孕前减脂可提高怀孕几率并有助于得到良好妊娠结局[8,9]。本研究发现复发性流产与痛经的发生具有一定的相关性，痛经为子宫内膜异位症的典型临床表现，本课题所研究的CA125及E-cadherin在内异症中存在明显异常表达[3,6]，有报道复发性流产可能与子宫内膜异位症导致的内膜容受性下降有一定关系。对于行辅助生殖的女性，IVF-ET低雌激素水平可能影响胚胎着床发育，使得发生复发性流产的风险增加[10]。胚胎发育过程中，胎盘作为母胎之间的重要介质尤为关键，本课题重点研究母体血清学免疫指标及母胎界面免疫指标异常所导致的复发性流产，以期寻找发病机制及治疗方向。

CA125是一种来源于体腔上皮、生殖道黏膜与卵巢的肿瘤抗原标志物，目前在妇产科被广泛应用，用于诊断卵巢上皮性肿瘤、子宫内膜异位症等疾病[11]。有研究表明，CA125存在于胎儿绒毛膜、羊水及母体蜕膜中[12]，这也可能是部分患者妊娠过程中CA125轻度升高的原因。目前有研究发现，当发生先兆流产时，母体血清CA125水平较升高，血清CA125水平可进一步用来预测先兆流产的发生[13]。本研究结果显示，复发性流产患者血清及蜕膜组织中CA125水平均明显高于正常妊娠患者，表明CA125同样参与了复发性流产的发生，可作为评估复发性流产患者的指标，这可能与流产时蜕膜细胞破坏，CA125漏出于细胞外，并随血液循环进入母体从而使患者血清CA125水平升高有关。

E-cadherin是一种 Ca2+依赖黏附分子，是一种跨膜钙依赖型细胞-细胞粘附分子，其表达的缺失是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)最重要的标志性变化。E-cadherin广泛在各类上皮细胞中表达，在上皮细胞、组织形成和肿瘤抑制中发挥关键作用[14]。有动物实验表明，在小鼠中发现E-cadherin在着床胚胎和子宫上皮细胞中均有表达，并随着妊娠天数的增加呈现出逐渐降低的趋势[15]。Bellati等[16]进行的回顾性研究表明非孕期子宫内膜组织低表达E-cadherin与不孕与复发性流产发病相关，本研究结果显示复发性流产患者蜕膜组织中E-cadherin较正常妊娠组织中表达降低，说明复发性流产患者蜕膜组织中E-cadherin表达不足从而导致的蜕膜细胞生长、浸润能力下降，与以往文献报道[17,18]一致，同时本研究结果发现，低表达E-cadherin并未反应致患者血清中，可能与其在正常组织含量较低并在复发性流产组织中呈低表达相关。

朱启全等[19]指出E-cadherin在乳腺癌癌组织中的表达减少而CA125异常升高，是导致癌细胞更容易发生浸润和转移的因素。肿瘤发生转移的关键是通过上皮-间质转化(EMT)来实现，EMT程序的活化使得细胞膜上的E-cadherin表达降低[20]，根据这一原理可以推测，CA125是否也可以通过调节蜕膜组织中E-cadherin的表达而参与复发性流产过程的发生。因此，本研究观察了复发性流产的蜕膜组织中CA125与E-cadherin的表达，并分析了两者的相关性。结果显示复发性流产的蜕膜组织中高表达CA125与低表达E-cadherin呈负相关，说明CA125可以通过降低E-cadherin的表达而促进复发性流产的发生。Wnt/β-catenin信号通路活化后可上调ZEB1的表达，而后者是E-cadherin基因启动子，抑制E-cadherin的表达[21]；Peinado等[22]指出NF-κB/p65可直接与Snail启动子的某个区域结合，激活Snail的转录，从而直接抑制E-cadherin的表达。而CA125均可激活上述信号通路而发挥作用[23-25]，因此我们认为CA125与E-cadherin关系密切，CA125可通过多种信号通路调控E-cadherin的转录和表达，从而参与复发性流产的发生及发展。下一步，我们将对其具体的分子机制进性研究。

综上所述，CA125在复发性流产患者血清及蜕膜组织中高表达，并且与E-cadherin的低表达呈负相关，说明CA125参与了复发性流产的发生，而其作用机制与调控E-cadherin表达有关，为复发性流产的发病机制体提供了新的思路和理论依据，为其诊断及治疗提供了新的方向。