青贮玉米中乳酸菌的分离和鉴定*

宗亚倩，鲁洪智，段新慧，周 凯，单贵莲，何承刚 ，姜 华

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[1-2]。乳酸菌用途广泛，在酿酒、奶制品加工和药品等行业都起着重要作用；同时，也是饲料青贮成功的关键物质[3]。它产酸能力强，能将饲料中的可溶性糖转化成乳酸，抑制不良发酵，更好地保存饲料中的营养成分[4]。

在养殖业快速发展的大环境下，青贮玉米既可满足饲草料的需求又能缓解中国粮食供需矛盾，是解决畜牧业发展与青贮饲料供给不足的有效途径[5]。青贮饲料中微生物的种类会随青贮环境和发酵条件的不同而有显著差异[6]，因此，学者们针对不同地区的青贮玉米进行了乳酸菌的分离及筛选。胡勇等[7]从青海省青贮玉米中分离得到的乳酸菌主要是帕氏乳杆菌(Lactobacillus parafarraginis)和希氏乳杆菌(Lactobacillus higardii)；赵子夫[8]从内蒙古不同地区青贮玉米中筛选的2株乳酸菌分别为消化乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)和果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)；吴书奇等[3]从南疆青贮玉米中分离的乳酸菌分别为葡萄球菌属(Staphylococcus)和芽孢杆菌属(Bacillu)。可见，不同地区青贮玉米中乳酸菌的种类不尽相同，而对于云南地区青贮玉米中乳酸菌的分离及鉴定鲜有报道。因此，本研究以云南省龙陵县种植的全株青贮玉米为材料，通过形态特征、生理指标分析及16S rDNA序列分析等方法筛选优质乳酸菌，以期为青贮乳酸菌接种剂的研发奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在乳熟期全株收割大天1号青贮玉米，用铡刀铡至段长2～3 cm，充分混合均匀后，装入青贮袋，每袋20 kg，密封，设置3次重复，于60 d后开袋取样。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的分离和纯化

取10 g青贮样品，加入90 mL灭菌生理盐水中，置于摇床上振荡1 h后，用无菌生理盐水稀释，取稀释度为10-4，10-5和10-63个梯度的稀释液各0.5 mL均匀涂布于MRS固体培养基中，于37 ℃恒温培养36 h。挑选长势比较好的单个菌落进行分离纯化。参考《常见细菌系统鉴定手册》[9]对菌株进行初筛。

1.2.2 乳酸菌的产酸测试

初筛得到的菌株过夜培养，按5%的接种量接种到MRS液体培养基中，于37 ℃培养箱中培养36 h，测定其pH值。

1.2.3 乳酸菌的生长曲线绘制

初筛得到的菌株过夜培养，按5%的接种量接种到MRS液体培养中，于37 ℃培养箱中培养36 h，每隔4 h取1次发酵液，在波长600 nm下测定样品的吸光度值(OD值)，以培养液为空白对照，绘制生长曲线。

1.2.4 乳酸菌的16S rDNA基因序列测定

采用的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自上海生工(产品编号：B518225)，参照产品说明书对菌株培养液进行DNA提取。以细菌基因组DNA为模板，以27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′为扩增引物序列进行PCR扩增反应，反应体系为：10 μmol/L引物1.0 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶0.3 μL，模板1.0 μL，加超纯水至25.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。得到的PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将提取的乳酸菌基因组DNA送往上海生工生物有限公司测序，利用NCBI检索系统在数据库中进行BLAST比对。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的形态学特性

从青贮样品中分离得到7株乳酸菌，命名为Z1～Z7，其形态特征如表1所示。7株菌株均为白色，有凸起，表面湿润，菌落形状均为圆形。其中，Z1、Z6及Z7菌落较大；Z4和Z5为中等大小，有钙圈；Z2和Z3菌落最小且有钙圈。7株菌株革兰氏染色均为阳性，过氧化氢触酶试验均为阴性，初步鉴定为乳酸菌。

表1 菌落形态学特性Tab.1 Colony morphology of lactic acid bacteria strians

2.2 乳酸菌的产酸能力

由表2可知：培养4 h时，各菌株的pH值均下降，其中Z2菌株的pH值显著高于Z3菌株(P<0.05)，其他菌株间差异不显著(P>0.05)；培养8 h时，Z2菌株的pH值显著高于Z1、Z3和Z7菌株(P<0.05)；培养12 h时，Z2和Z4菌株的pH值显著高于Z3和Z7菌株(P<0.05)；培养24 h时，Z2菌株的pH值显著高于其他菌株(P<0.05)，Z4菌株的pH显著高于除Z2菌株以外的其他菌株(P<0.05)；培养36 h时，Z2和Z4菌株的pH值显著高于其他菌株(P<0.05)。随着培养时间的延长，各菌株的pH值均在培养12 h内显著下降(P<0.05)；培养24 h时，只有Z1和Z2菌株的pH值仍然显著下降(P<0.05)；培养36 h时，各菌株的pH值变化不显著(P>0.05)。总体看来，Z2和Z4菌株产酸能力较弱，Z1、Z3、Z5、Z6和Z7菌株产酸能力较强。

表2 培养时间对乳酸菌pH值的影响Tab.2 Effect of culture time on the pH of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌的生长曲线

由图1可知：7株乳酸菌中，Z1、Z3和Z7菌株可以快速进入对数生长期，适应性强，适应周期短，4～8 h进入生长期，生长速度最快，8～12 h进入稳定期，之后生长速度缓慢，在发酵过程中没有出现明显的衰退期。Z1、Z3和Z7菌株的OD值分别达到2.47、2.33和2.19，在整个培养过程中，生长最快的是Z1菌株，生长曲线与产酸结果基本一致。Z2、Z4、Z5和Z6菌株生长速率缓慢，培养迟缓期长，不适宜作为乳酸菌添加剂。

图1 乳酸菌生长曲线Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria strains

2.4 乳酸菌的16S rDNA序列分析

由表3可知：Z1、Z2、Z3、Z6和Z7菌株的16S rDNA序列信息与NCBI数据库中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的基因序列相似度在99%以上，故确定这5株菌株为植物乳杆菌；Z4和Z5菌株与数据库中不动乳杆菌(Acinetobactersp.)的基因序列同源性均在99%以上，故Z4和Z5为不动乳杆菌。

表3 乳酸菌株16S rDNA序列BLAST比对结果Tab.3 BLAST results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

3 讨论

青贮发酵是由多种微生物共同参与完成的，而参与青贮过程的微生物主要来自牧草表面附着的微生物[10]。其中，乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、乳球菌属(Lactococcus)和肠球菌属(Enterococcus)等在青贮饲料发酵中起关键作用[11]。随着乳酸菌的迅速繁殖，发酵体系中的pH值开始下降，会抑制大部分好氧细菌、大肠杆菌和霉菌等不利于青贮发酵的微生物繁殖[12]，使得发酵品质更佳。因此，从青贮饲料中筛选优质乳酸菌对发酵品质具有重要作用。

本研究对分离出的7株乳酸菌通过形态学观察、产酸速率和生长曲线进行初步筛选，并通过16S rDNA基因序列分析方法对菌株进行进一步鉴定。16S rDNA同源序列分析方法常应用于微生物种和亚种的鉴定，其规定2个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5%，则认为他们属于同一个种[13]。本研究筛选出的3株菌株Z1、Z3和Z7在NCBI数据库中进行BLAST相似性对比，其相似度在99%以上，由此确定3株乳酸菌菌株均为植物乳杆菌。大量研究[10,14-15]表明：植物乳杆菌不仅可从青贮玉米中筛选，在其他青贮牧草中同样有发现。郭艳霞等[10]从青贮发酵的甘蔗尾中分离出20株乳酸菌，其中17株为植物乳杆菌；潘小梅等[14]从青贮的柑橘皮渣中分离出7株乳杆菌属菌株，其中最优良的1株为植物乳杆菌；王红梅等[15]从呼伦贝尔草原野生牧草青贮中筛选出的优质菌株也有植物乳杆菌。由此可见，本研究从青贮玉米中筛选出的3株优势乳酸菌菌株有潜力成为青贮饲料乳酸菌添加剂。

产酸速率和生长速率也是青贮添加剂的重要指标。MCDONALD等[16]指出：青贮添加剂的菌种应具备繁殖速度快、竞争力强、耐酸程度高、pH值降低快、产酸速度快且产酸量大、可广泛地利用各种可溶性糖等条件。本研究筛选出的7株乳酸菌，其中4株不具备作为青贮添加剂菌种的条件；但Z1、Z3和Z7产酸能力强，繁殖速度快，在36 h时pH值分别为3.79、3.76和3.38，OD值分别为2.47、2.33和2.19。这与崔棹茗等[17]从青稞秸秆青贮饲料中筛选的植物乳杆菌研究结果相似，其菌株在36 h时pH值降低到3.6以下，OD值在24 h时升至2.4以上。综合这2项指标，筛选出的这3株植物乳杆菌菌株可作为潜在的青贮添加剂后备菌种。

4 结论

本研究从青贮玉米中共筛选出7株乳酸菌，其中Z1、Z3和Z7产酸能力强，繁殖速度快，均能在12 h内pH值下降到4以下、吸光度值(OD值)升至2以上，经16S rDNA序列分析鉴定均为植物乳杆菌，可作为青贮添加剂的备选菌种。