大麦成熟籽粒中15种黄酮类化合物的含量差异分析*

贺军与，钟 伟，陈云琼，熊静蕾，王卫斌，蒋亚丽，施辉蒙，陈升位

(云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

大麦成熟籽粒中的黄酮类化合物由苯丙烷代谢途径合成，具有抗氧化、预防心血管疾病和抑制癌细胞生长等药用和保健价值[1-6]。不同学者采用紫外可见分光光度法检测了大麦成熟籽粒中黄酮类化合物的总含量[7-9]，基于薄层层析和高效液相色谱技术鉴定了大麦籽粒中的槲皮素、杨梅素和山奈酚等黄酮类化合物，并测定了部分化合物的含量[7,10-14]。在大麦不同成熟籽粒间黄酮类化合物总含量[4,7]和特定化合物含量均存在明显差异[7,10-12,15-16]，如云啤2号、功麦3号和北青7号等成熟籽粒间黄酮类化合物的含量差异高达3倍以上。不仅如此，相同基因型的成熟籽粒中不同化合物的含量也不同[7,10-12]。有研究表明：环境因素可影响大麦成熟籽粒黄酮类化合物的含量，而大麦基因型是导致该差异的主要因素[8,13-14,16-18]，并将花色苷含量QTLs定位于Chr1H、Chr2H和Chr4H等6条染色体上[8,17]。与银杏、水稻和灯盏花等植物相比，已报道的大麦成熟籽粒黄酮类化合物还较少，特别是对二氢杨梅素、曲克芦丁和染料木苷等化合物的含量特性缺乏认识[1,18-19]。因此，本研究以8种遗传稳定、籽粒颜色不同的大麦品种(或品系)为材料，采用高效液相色谱鉴定其成熟籽粒中苯丙烷代谢分支节点上的15种化合物，并检测不同化合物的含量，分析不同材料成熟籽粒间黄酮类化合物的含量差异；基于含量差异，筛选15个化合物代谢特性的极端差异材料，为研究大麦成熟籽粒黄酮类化合物的积累机制和大麦品种的遗传改良提供理论依据和试验材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

8种材料均为遗传稳定的品种或品系，其中3种为地方品种，其余为育成品种(或品系)，其基本特性见表1。所有材料由本课题组繁育并保存。

表1 试验材料及其基本特性Tab.1 The materials used in the study and the basic characteristics

1.2 材料繁育

试验材料均种植于云南农业大学教学试验农场，播种期为2018年11月9日。随机排列，每个品系种植6行，每行20株，行距20 cm，株距5 cm，重复3次。其他管理措施与常规大田生产一致。

1.3 黄酮类化合物提取与纯化

在完熟期收获8种材料的成熟籽粒，用锡箔纸包裹后装入牛皮纸袋置于-80 ℃冰箱储存、备用。采用LGJ-12C真空冷冻干燥机干燥成熟籽粒，用AM600研磨仪将干燥的籽粒碾磨5 min至粉末状。等量混合3个重复的成熟籽粒粉末，分别构建不同材料的样品池，每个样品池称取2.0 g粉末溶于20.0 mL 70%的甲醇溶液，采用YQ-1001A超声波清洗仪辅助处理浸提液30 min，取上清液。采用0.22 μm的微孔滤膜过滤，纯化提取物。

1.4 高效液相色谱标准品制作

将二氢杨梅素、曲克芦丁和染料木苷等15种标准品(表2)溶入70%甲醇，分别配制100 mg/L母液，置于4 ℃暗储存，备用。基于15种标准品母液分别配制1、2、4、8、16、32、64和128 μg/mL的工作液以及与15种标准品不同质量浓度的混合工作液，并采用 Agilent 1200 Infinity Series高效液相色谱仪(产地：德国)对其滞留时间及色谱峰进行高效液相色谱检测。色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(5 µm×4.6 mm×150 mm)；流动相：A相为0.1%的冰醋酸，B相为乙腈；洗脱梯度：0 min，A∶B (V/V)=95∶5，60.0 min，A∶B (V/V)=5∶95，60.1 min，A∶B (V/V)=95∶5，65.0 min，A∶B (V/V)=95∶5；流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样量为10 μL；检测波长：280 nm。重复试验3次。基于SPSS 20.0中回归模块默认参数构建标准品峰面积与质量浓度的回归方程(相关系数R≥0.99)。

表2 检测的15种化合物Tab.2 The 15 compounds of tested

1.5 黄酮类化合物及其含量差异分析

根据出峰时间定性鉴定黄酮类化合物，利用标准品峰面积与质量浓度的回归方程计算样品质量浓度，并将其转换为含量。基于SPSS 20.0中方差和多重比较模块默认参数分析化合物含量差异，显著和极显著水平分别为5%和1%。

2 结果与分析

2.1 可有效检测的黄酮类化合物

由表3可知：在Bowman、光头大麦和云南高世代成熟籽粒中检测到9种化合物，Morex成熟籽粒中检测到12种化合物，淳安六棱胭脂大麦和定海红绿黄成熟籽粒中检测到11种化合物，紫青稞成熟籽粒中检测到10种化合物，北青7号成熟籽粒中仅检测到7种化合物。其中，曲克芦丁在8种材料中均检测到，其余化合物只在部分材料中检测到。

表3 8种成熟籽粒中检测到的黄酮类化合物Tab.3 The flavonoids compound detected in eight barley mature grains

2.2 黄酮类化合物的含量差异分析

2.2.1 15种化合物总含量的差异分析

在8种材料的成熟籽粒中，15种化合物的总含量变幅为(40.31±3.92)～(319.22±10.69) μg/g。多重比较结果(图1)表明：紫青稞成熟籽粒的化合物总含量极显著或显著高于其他7种材料的化合物总含量。Morex、光头大麦和淳安六棱胭脂大麦3个品种间化合物总含量无显著差异，但极显著或显著高于Bowman、定海红绿黄、云南高世代和北青7号的化合物总含量；定海红绿黄成熟籽粒的化合物总含量极显著高于Bowman和北青7号，且显著高于云南高世代的化合物总含量；Bowman、北青7号和云南高世代3种材料成熟籽粒间的化合物总含量无显著差异。

图1 8种大麦成熟籽粒中黄酮类化合物总含量Fig.1 The total content of flavonoids compounds in eight eight barley mature grains

2.2.2 不同大麦成熟籽粒间化合物含量的差异分析

由表4可知：在8种大麦成熟籽粒中，黄豆黄素、槲皮素、柚皮素查尔酮、芹菜素、芒柄花素和白杨素的含量在Morex中最高，二氢杨梅素、曲克芦丁和染料木苷的含量在淳安六棱胭脂大麦中最高，木犀草素、山奈酚和山奈素的含量在紫青稞中最高，柚皮素和二氢槲皮素的含量在定海红绿黄和云南高世代中最高。

多重比较结果(表4)表明：黄色籽粒间共有9种化合物的含量存在差异，其中芹菜素和白杨素在3个品种间达到显著或极显著差异，二氢杨梅素和槲皮素等11种化合物在Bowman与光头大麦间无显著差异，二氢槲皮素含量在Morex与光头大麦间无差异，杨梅素含量在Bowman与Morex间无差异；紫色籽粒间除白杨素外其余14种化合物的含量均有差异，芒柄花素和山奈酚的含量在3种材料间差异极显著，其余化合物的含量在其中2种材料间差异显著或极显著。

表4 不同大麦成熟籽粒中15种黄酮化合物的平均含量及其差异Tab.4 The mean contents of 15 flavonoids in mature grains of different barley and difference between the mean contents μg/g

由表4还可知：黄色籽粒与紫色籽粒间差异化合物最多为12种(Morex和紫青稞)，最少为3种(Bowman和定海红绿黄)；与黑色籽粒间差异化合物最多为10种(Morex和云南高世代)，最少为2种(Bowman和云南高世代)；与蓝色籽粒间差异化合物最多为12种(Morex和北青7号)，最少为3种(光头大麦和北青7号)。紫色籽粒与黑色籽粒间差异化合物最多为9种(淳安六棱胭脂大麦和云南高世代)，最少为4种(定海红绿黄和云南高世代)；与蓝色籽粒间差异化合物最多为10种(淳安六棱胭脂大麦和北青7号)，最少为4种(紫青稞和北青7号)。黑色籽粒与蓝色籽粒间仅木犀草素和芹菜素的含量差异达显著水平，其余化合物的含量均无差异。

3 讨论

本研究采用高效液相色谱检测了8种大麦成熟籽粒的二氢杨梅素、曲克芦丁和染料木苷等15种化合物，其含量变幅为0～(223.41±8.44) μg/g。虽然已有报道大麦籽粒中儿茶素、杨梅素和山奈酚等化合物的含量，但鲜有染料木苷、曲克芦丁和黄豆黄素等7种化合物的含量报道[1-2,7-12,18-19]。杨晓梦等[8]和周明等[18]检测了25种大麦材料成熟籽粒的9种黄酮类化合物，发现其含量变幅为0.00～(348.88±3.80) μg/g，其中大多数化合物的含量变幅与本研究报道的基本一致。在不同成熟籽粒中可有效检测到15种化合物，表明大麦籽粒具有合成相应化合物的有效代谢途径。不同材料的成熟籽粒间可有效检测的共有化合物明显不同，在Morex与淳安六棱胭脂大麦、Morex与定海红绿黄、淳安六棱胭脂大麦与定海红绿黄成熟籽粒中可检测到9种共有化合物，但在Morex与光头大麦、Morex与北青7号及光头大麦与北青7号等6对成熟籽粒间仅能检测到5种共有化合物。从含量来看，在不同成熟籽粒间特定化合物的含量也存在较大差异，如淳安六棱胭脂大麦成熟籽粒中曲克芦丁和染料木苷的含量极显著高于其他14种大麦成熟籽粒。

不同颜色的多对成熟籽粒(黄色籽粒与紫色籽粒)间与相同颜色(黄色或紫色)籽粒相比差异化合物偏少。育成品种籽粒和地方品种籽粒相比，育成品种与地方品种的多对籽粒间差异化合物也偏少。因此，15种化合物在不同成熟籽粒间的代谢互补性与籽粒颜色(黄色或紫色)和品种属性(育成品种或地方品种)没有明显的关联性。作者认为：可能是代谢酶基因的中性突变削弱了相同颜色、育成品种或地方品种成熟籽粒间15种化合物的代谢关联性。在8种成熟籽粒中，Morex与紫青稞成熟籽粒间仅有6种共有化合物，Morex与北青7号成熟籽粒间仅有5种共有化合物，且共有化合物的含量存在明显差异(如杨梅素、柚皮素和山奈酚等)，其中杨梅素和山奈酚在材料间的含量差异大于谢文英等[10]、ABDEL-AAL等[19]和余春磊等[20]的研究，说明上述2对大麦材料的籽粒间15种化合物的代谢互补性较高。Morex、紫青稞和北青7号属不同的生态类型，其中北青7号和紫青稞是云南省迪庆州的主推青稞品种，Morex是国外啤酒大麦育成品种，3种材料的农艺性状间遗传互补性也较高，如北青7号和紫青稞属裸大麦，而Morex属皮大麦。因此，上述材料可用于大麦成熟籽粒黄酮类化合物的积累机制以及保健大麦育种等的研究。

4 结论

本研究8种大麦材料成熟籽粒中可有效检测的化合物为7～12种，其中曲克芦丁在所有材料中均检测到。材料间15种化合物总含量差异显著或极显著，黄色籽粒间9种化合物的含量差异显著或极显著，紫色籽粒间除白杨素外其余14种化合物的含量差异显著或极显著，不同颜色的籽粒间差异化合物为2～12种。研究结果对解析大麦成熟籽粒黄酮类化合物的积累机制具有重要的理论意义。