miR-100-5p靶向mTOR信号通路调控人非小细胞肺癌A549细胞自噬

桂坤 黄昱 王美锦 欧阳伟炜

(1贵州医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，贵州 贵阳 550004；2贵州省肿瘤医院胸部肿瘤科)

肺癌是全球性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。据统计，2012年约有160万人死于肺癌，占全球癌症死亡人数的19%〔1〕。事实上，仅肺癌死亡人数就超过了紧随其后的3种最常见癌症：结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的死亡人数的总和〔2〕。目前临床上肺癌的治疗主要是以手术治疗为主，辅以放疗、化疗和药物治疗等综合治疗。然而，与绝大多数实体瘤一样，肺腺癌存在多种原癌基因诱发、耐药性高、恶性侵袭转移等问题，使其针对性的治疗和筛查十分困难。因此，确定非小细胞肺癌(NSCLC)的详细分子机制及寻找新的生物标志物，将有助于开发更好、更具体的临床治疗方法。表观遗传调控机制在诱发基因突变，进而促进肿瘤发生、发展中起到关键性作用。miRNAs是一类短、非编码RNA分子(约22个核苷酸长)，通过与靶向mRNA的3′非翻译区结合，阻碍靶基因的表达，在基因转录后调控发挥关键作用〔3〕。miRNAs主要参与了细胞增殖、凋亡、代谢等关键细胞功能，常被认为与肿瘤的发生发展密切有关。细胞自噬是控制细胞存活和死亡的重要生理活动〔4〕。mTOR是一种保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，具有多种生理功能，如细胞周期调节、增殖、分化、运动和侵袭等。事实上，自噬在肿瘤的发生过程中起着双刃剑的作用〔5〕。mTOR通常被认为是一种促生长因子，是凋亡的抑制剂。细胞应激后，mTOR下调抑制细胞生长和增殖，促进自噬和凋亡。而细胞质中p53可抑制mTOR信号传导，抑制自噬。研究发现miR-100在多种肿瘤中通过靶向mTOR影响其发生发展，这对未来肿瘤的靶向性治疗研究提供了很好的参考价值〔6〕。我们将miR-100-5p的模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor)转染A549细胞，采用实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)检测转染后miR-100-5p、自噬相关基因Beclin1、LC3、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2及mTOR的相对表达量，同时检测细胞的凋亡率，采用荧光素酶实验检测A549细胞中miR-100-5p与mTOR诱导的自噬之间的关系。本研究旨在探讨miR-100-5p调控自噬相关的信号通路mTOR，参与肿瘤自噬过程，进一步揭示miRNA涉及表观遗传在肿瘤细胞调控的详细机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 人肺腺癌细胞系A549购自中国科学院上海细胞库。DMEM高糖培养基及胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；miR-100-5p mimics、miR-100-5p干扰序列inhibitor和对应的阴性无关序列NC由上海吉玛公司设计合成；Lipofectamine2000转染试剂购自Thermo Fisher公司。青霉素及链霉素购自美国Invitrogen公司。本研究所使用的抗体：GAPDH抗体mTOR蛋白抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自生工生物工程(上海)公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒、蛋白裂解液及Trizol试剂购自美国Thermo Scientific公司；所有引物由生工生物公司提供。细胞培养瓶、细胞冻存管购自美国Corning公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人肺癌A549细胞株由中国科学院上海细胞库提供，采用含10%FBS的DMEM完全培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中进行培养。选取对数生长期的A549，以4×105个细胞每孔的密度接种于6孔培养板，培养过夜后观察细胞融合情况，以进行后续实验。

1.2.2细胞转染实验 对于6孔板中培养的A549细胞，待其贴壁融合至70%～80%时，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后使用Lipofectamine2000试剂进行转染实验，实验分为5组，设置如下(每组有3个平行样)：对照组、mimics组、mimics NC组、inhibitor组和inhibitor NC组。参照Lipofectamine2000操作说明书，将miR-100-5p mimics，miR-100-5p mimics NC，miR-100-5p inhibitor和miR-100-5p inhibitor NC与Lipofectamine 2000按比例混合，室温静置20 min。每孔中加入200 μl，20 nmol/L的核酸，补Opti-MEM至1 ml，对照组加入等体积溶剂对照。转染6 h后换成完全培养基，继续培养48 h后，使用细胞刮刀收集细胞用于后续鉴定实验。

1.2.3实时荧光定量PCR检测miR-100-5p与mTOR的相对表达检测 使用Trizol 裂解液提取收集转染与未转染的A549细胞的总RNA，具体操作如下：细胞悬液先经800 r/min离心5 min后，去除上清液，加入1 ml的裂解液，使用振荡器振荡混匀数下，将样品放在室温下5 min，随后在4℃ 12 000 r/min离心5 min，留取上清，放入一个无核糖核酸酶(RNase)离心管中，加入200 μl氯仿，经上下剧烈振荡数秒，随后在室温下放置5 min，再4℃ 12 000 r/min离心10 min再将水相取出，加入与转移液等体积的异丙醇混合放入-20℃中30 min，4℃ 12 000 r/min离心30 min，再加入100 μl的75%乙醇沉淀后，加入100 μl的无水乙醇清洗1遍后，加入15～30 μl RNase-Free ddH2O2，室温溶解。使用TaKaRa 反转录试剂盒对总RNA(约500 ng)进行逆转录，采用PCR扩增自噬基因Beclin1，LC3和内参基因GADPH；miR-100-5p及内参U6。Beclin1的引物正义链：5′-GGAGCTGCCGTTATACTGTTC-3′，反义链为5′-TCTCCACATCCATCCTGTAGG-3′；LC3的引物正义链：5′-GGTGATCATCGAGCGCTACA-3′,反义链：5′-CGCCGGATGATCTTGACCAA-3′；GADPH的引物为正义链为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反义链：5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；mTOR的引物正义链：5′-AGGCCTTGGTGAGAGCTGTA-3′，反义链：5′-GGCACACATTTGAAGAAGCA-3′；U6的引物正义链：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡情况 分组方法同1.2.2，培养48 h后，弃掉细胞上清液，用PBS洗1遍，0.25%胰蛋白酶进行消化，PBS洗涤2遍调整细胞密度成1×106个/ml悬液，依次加入5 μl的Annexin V-FITC与3 μl的PI，室温避光孵育10 min，使用BD流式细胞仪系统进行检测，实验重复3次取平均值。

1.2.5Western印迹 将各组细胞样本PBS清洗，RIPA裂解液冰上裂解30 min，离心测上清中蛋白的浓度，加入适量的1×十二烷基硫酸钠(SDS)结合缓冲液，煮沸5 min。采用不连续系统蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，待转膜完成后，马上将聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入TBST溶液中漂洗1～2 min，随后加入5%脱脂奶粉封闭液，于室温下封闭1 h。孵育一抗：先按蛋白Marker将PVDF膜剪开转膜后，参考一抗附说明书要求的比例稀释一抗，4 ℃孵育过夜，接着加入TBST洗涤液清洗3次，每次持续15 min；孵育二抗：参考二抗使用说明书，按1∶2 000的比例稀释辣根过氧化物酶(HPR)标记的二抗，接着将PVDF膜加入已经稀释好的二抗，在室温下孵育60 min；最后置于TBST洗涤3次，每次15 min；显色后拍照。

1.2.6靶基因预测及双荧光素酶报告基因测定 靶基因预测采用Targetscan软件预测miR-100-5p下游靶基因，随后采用双荧光酶素报告基因检测进行鉴定。操作如下：转染前1 d将细胞接种于24孔板，使用Lipo fectamine 2000混合miR-100-5p mimics和含有野生型与突变型mTOR 3′UTR的报告基因质粒共转染A549细胞。培养48 h后，将收集的细胞转移到1.5 ml EP管中，液氮反复冻融两次，4℃，12 000 r/min离心5 min，收集上清，转移到新的1.5 ml EP中，获得细胞提取液。将细胞提取液及荧光素酶反应底物25℃水浴10 min。在新的离心管中分别加入100 μl荧光素酶反应底物及20 μl细胞提取液，振荡混合，15 s内读数。

1.3统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1A549细胞中miR-100-5p和mTOR的相对表达情况 A549细胞经过瞬时转染后，对照组、mimics NC组、inhibitor NC组的miR-100-5p、自噬相关基因mTOR、Beclin1、LC3和Bcl-2表达量差异无统计学意义(P>0.05)，与mimics NC组比，mimics组miR-100-5p、自噬相关基因表达量显著上调(P<0.05)，与inhibitor NC组比，inhibitor组miR-100-5p、自噬相关基因表达量显著下调(P<0.05)，与mimics组和mimics NC组比较， inhibitor组miR-100-5p、自噬相关基因表达量显著下调(P<0.05)，见表1。

表1 各组A549细胞中miR-100-5p和mTOR的相对表达情况

2.2miR-100-5p诱导A549细胞凋亡 对照组、mimics NC组、mimics组、inhibitor NC组、inhibitor组A549细胞转染48 h细胞凋亡比例分别为(5.87±0.78)%，(5.46±0.99)%，(10.40±1.75)%，(5.47±0.68)%，(5.28±1.02)%，各组差异有统计学意义(F=35.169，P<0.001)。mimics组A549细胞转染48 h细胞凋亡比例显著高于其余组(均P<0.05)。

2.3转染后细胞中自噬相关基因蛋白表达情况 对照组、mimics NC组、mimics组mTOR蛋白水平分别为0.42±0.13，0.13±0.04，0.92±0.24，mTOR蛋白水平比较：mimics组>对照组>mimics NC组(F=56.661，P=0.000)。见图1。表明mTOR为miR-100-5p的直接靶基因，miR-100-5p对mTOR呈正向调控，具原癌基因作用，在肺癌细胞中促进自噬，抑制凋亡密切相关。

图1 转染miRNA mimics的肺癌细胞自噬蛋白mTOR的表达

2.4mTOR是miR-100-5p的靶基因 mTOR是miR-100-5p的靶基因mTOR报告基因活性mimics组(1.03±0.11)、mimics+野生型组(0.49±0.06)和mimics+突变型组(1.07±0.12)，3组mTOR报告基因活性存在差异(F=26.417,P=0.000)。与mimics组比，mimics+野生型组mTOR报告基因活性明显降低，差异有统计学意义(t=12.929,P=0.000)；与mimics组比，mimics+突变型组mTOR报告基因活性无明显增高，差异无统计学意义(t=0.737,P=0.482)；与mimics+野生型组比较，mimics+突变型组mTOR报告基因活性明显增高，差异有统计学意义(t=12.969,P=0.000)。表明miR-100-5p mimics能使细胞的野生型mTOR下调，而对突变型报告基因活性的影响无明显差异，miR-100-5p均可以靶向抑制mTOR使其表达下调。

3 讨 论

肺癌是世界范围内最常见的癌症，其特点是对化疗和放疗均具有高耐药性和复发率，死亡率极高，约占全球癌症相关死亡总数的四分之一以上〔7〕。早期肺癌可进行手术切除以获得较高的治愈率，但晚期肺癌存在侵袭性转移明显降低了治疗效果〔8〕。按照病理组织学分类可将肺癌分为两个亚型，NSCLC(85%)和小细胞肺癌(SCLC，15%)，两者治疗方法和机制存在一定的差异。其中，在NSCLC中，多种基因的突变、缺失和重组会诱发信号通路和生理活动的异常〔9〕。此外，NSCLC进一步分为3种主要的亚型，包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。鳞状细胞癌占20%～30%，通常发现于靠近气管的肺部中心。腺癌占40%～70%，发生于肺部外侧。大细胞癌占10%～15%，发生于肺组织内部〔10〕。目前，NSCLC的免疫检查点抑制剂的使用极大地促进了临床肿瘤免疫治疗的快速发展。

miRNAs是一种非编码、进化保存的小分子RNA，能够通过不同的机制调控基因表达〔11〕。研究表明miRNAs在肺部疾病的发展中起着重要的作用〔12，13〕。据报道，肺癌患者肿瘤组织中Dicer酶的水平显著降低，对其预后生存率有明显影响，而Dicer是miRNAs成熟所必需的酶〔14〕。在SCLC中，miR-17～92过表达促进肿瘤的发生和血管的新生〔15〕。Liu等〔16〕也证实了miR-31在NSCLC中抑制肿瘤发展的抑制基因。此外，在非吸烟者和吸烟者肺癌患者中，miR-21均有较高的表达水平〔17〕。miR-100位于mir100HG簇，是一种长链非编码RNA，也产生let-7和miR-125b。这3个成熟的miRNA都参与了癌症的发生和发展〔18，19〕。在肺癌中，let-7的表达通常较低，这对接受手术治疗的患者的生存有负面影响〔20〕。研究表明，miR-100-5p可能通过靶向mTOR诱导SW480细胞的自噬死亡〔21〕。Wang等〔22〕报道miR-100-5p在缺氧诱导的大鼠肺动脉高压中可抑制mTOR信号通路。自噬失调在肿瘤的发病不同的病程中调控机制存在差异〔23〕。自噬在肺癌的发展中扮演极其重要的作用，在促进NSCLC细胞凋亡中具有两面性。一般来说，自噬的抑制限制了细胞克服压力和维持稳态的能力〔24〕。

研究表明miR-100在高转移能力的A549中呈低表达，具有类似抑癌基因〔25〕。本研究结果提示miR-100-5p在自噬调控中作用十分重要。