骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展*

王文华， 刘 洋， 吕 洋， 赵亚如， 王海萍

河北北方学院干细胞与生殖生物学实验室，张家口 075000

近年来，尽管社会经济稳步提高，但是心血管疾病的患病率却居高不下。在临床上发现，心肌梗死(myocardial infarction，MI)伴随着心肌细胞的缺血、缺氧、凋亡坏死，梗死的组织被瘢痕组织代替，造成心肌局部功能障碍、心室重塑和扩张，最终演变成心力衰竭。目前MI的治疗手段包括药物、介入、手术等综合治疗方法，但是不能从根本上治愈，只是在一定程度上缓解病情。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具备自我更新以及多向分化的能力，在体外特定环境下可分化为多种细胞，从而成为治疗心肌梗死最理想的种子细胞[1-2]，本综述对BMSCs的来源、特点、作用机制、诱导方法进行了系统的总结，为BMSCs在心血管疾病治疗中的作用提供参考。

1 BMSCs的生物学特性

BMSCs是一种能够从骨髓中分离出的多能干细胞，是一种成体干细胞(adult stem cells，ASCs)。它具有自我更新和多向分化的能力[3]，在体外通过特定的条件，可分化成脂肪、骨、软骨、成纤维、心肌等细胞[3-5]，同时BMSCs具有获取便利，操作简单的特点，且可以大量培养扩增[6]。BMSCs还具有免疫抑制的特点，自我调节免疫排斥反应，对自身免疫性疾病和器官移植而言是理想选择[7]。

2 BMSCs治疗心肌方面疾病的作用机制

BMSCs治疗心肌方面疾病的机制，主要为旁分泌作用。其可以分泌多种活性细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、细胞衍生因子-1(SDF-1)、趋化性细胞因子，这些细胞因子具有促进血管生成、炎症抑制、抗纤维化以及趋化归巢等作用，参与并协助BMSCs修复损伤的心肌组织[8-9]。BMSCs具有极化的作用，可以在急性炎症的环境下，使促炎型MSC1和抗炎型MSC2相互转化，从而缓解炎症对心肌细胞的损伤。有研究表明，当心肌组织受损时，炎症因子促使MI型巨噬细胞大量分化，产生的促炎因子，如IFN-γ和TNF-α，加速MSCs获得抗炎型MSC2，从而对淋巴细胞功能产生抑制作用，减少免疫反应，减少过度应激导致的组织损伤[10]。在一项研究中发现，在小鼠心肌梗死区域中人的脐血间充质干细胞可以将MSC1转换成MSC2，从而减轻炎症，改善心脏的功能[11]。BMSCs在归巢的作用中可以分泌CC趋化因子、HGF/c-Met等。CC趋化因子，包括CCL2、CCL3、CCL4均对细胞有趋化作用。有研究发现，通过过表达CCL3受体CCR1，可以使MSCs实现归巢，对受损心肌部位的作用显著提高[12]。c-Met作为HGF的受体，是一种酪氨酸激酶，二者相结合后，HGF/c-Met信号通路参与细胞的生长、增殖、迁移、抗凋亡、血管生成等[13]。

3 体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的方法

研究发现，体外条件诱导BMSCs向心肌细胞分化有多种方法。其中化学因素、生物因素等是最早且相对简单的诱导方式。除此之外还包括一些物理因素的干预、中药单体及复方等，在很多研究中发现一定的条件下均可以增强BMSCs向心肌细胞分化的效率[14-16]。

3.1 化学因素

5-氮胞苷(5-azacytidine，5-Aza)是最早、最经典的心源性化学诱导剂。Makino等[17]早在1999年就首次证实了在体外能够将间充质干细胞成功地诱导分化为心肌细胞，5-Aza的发现为药物诱导BMSCs向心肌细胞的分化奠定了坚实的基础。有研究表明，5-Aza在体外诱导形成的心肌细胞有肌管形成，且具有类似心肌细胞的肌小节结构和动作电位，这些都是心肌细胞独有的特征[18]。由于5-Aza属于细胞抑制剂，一直被应用于肿瘤治疗，但是其去甲基化作用可以使其作为一个心源性诱导剂，由于它具有一定的细胞毒性，对浓度的要求严格，所以单独运用5-Aza诱导的研究较少[19]。因此，有研究发现5-Aza与骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)联合使用可以减少细胞的凋亡，对心肌细胞具有保护作用[20]。

环磷腺苷葡胺(MCA)是环磷腺苷的衍生物[21]，具有一定的脂溶性，因此能轻易穿过脂溶性细胞膜对心肌发挥作用。主要是通过兴奋-收缩加强心肌收缩，增加心肌细胞代谢，恢复心肌功能[22-23]。周荣等[24]关于MCA对BMSCs向心肌细胞方向分化影响的研究中发现，MCA可以进入BMSCs，在cAMP/PKA信号通路的作用下可以促进BMSCs表达出心肌特异性基因。李丹等[25]在MCA对BMSCs诱导分化心肌细胞的研究中，证实了其参与诱导的主要机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关。

二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)主要的作用机制是通过抑制C-MYC基因的表达，从而使细胞内源性聚腺苷二磷酸核苷的水平降低。有研究证实，在体外通过DMSO诱导BMSCs向心肌细胞方向分化，分化后的心肌细胞具备心肌的表型。也有研究表明，DMSO对过氧化氢诱导的心肌细胞具有保护作用[26-29]。

3.2 生物因素

3.2.1 细胞因子 细胞因子属于生物因子，因此具有天然的亲和力。与其他外源试剂相比，具有很大的优势。参与心肌细胞分化的因子种类很多。有报道指出，心肌细胞是可以自分泌出TGF-β类生长因子，并能够调节心肌细胞平滑肌肌动蛋白、横纹肌肌动蛋白和β-肌球蛋白的表达[30]。在很多研究中发现TGF-β类生长因子是可以调节胚胎组织的重要生长因子，对心脏的发育具有重要作用[31]。BMP-2是TGF-β家族中重要一员，是心脏中重要的细胞因子，对胚胎发育具有一定的促进作用。同时还可以调节细胞的生长、分化和凋亡[32]。BMP-2在参与心脏发育的过程中可能与Cdc42、PAK、LIMK1、p38、MK2及Hsp25通路有关，在BMP-2诱导肌动蛋白和细胞迁移的过程中发挥重要作用[33-34]。此外，BMP信号通路调节心脏基因的表达，Smad1作为BMP信号通路的效应器，与心肌蛋白相互作用实现BMP信号通路在心血管发育中发挥作用[35]。有研究发现，BMP可以诱导鸡的非心脏前中胚层细胞中心脏转录因子的异位表达并使心肌细胞跳动，这表明BMPs可以参与心脏发育[36]。但是诱导后的心肌细胞是否是天然的心肌细胞还有待探讨。

3.2.2 模拟心肌微环境 模拟心肌微环境法包括直接接触共培养法和间接接触共培养法。间接接触共培养法只是在培养方式上不同于直接接触法。直接接触共培养方式不仅可以进行化学信号的融合，而且可以收到心肌细胞自发搏动而产生的机械牵拉和机械信号的感应。相反，间接接触共培养方式是通过物理屏障将两种细胞分开培养，尽管这两种细胞不能直接接触，但是依旧可以受到各自分泌的化学因子的作用和影响。直接接触共培养法包括心肌细胞裂解液法、冻融液法及与心肌细胞接触法。

心肌细胞裂解液法：主要是体外模拟心肌微环境[36]。有学者发现通过制备小型猪的心肌细胞裂解液，能够对hMSCs向心肌样细胞诱导分化发挥作用[37]，李琴等[38]发现通过制备小型猪的心肌细胞裂解液，能够对hMSCs向心肌样细胞诱导分化发挥作用。在心肌裂解液环境下，观察诱导BMSCs分化的心肌样细胞，在透射电镜和扫描电镜下均可以看到心肌细胞的表型结构，而且在连续诱导12 d后发现很多区域有自律性波动的多核肌管结构等，这些结果均可以说明良好的心肌微环境是可以提高诱导效率，并且诱导后的心肌样细胞具备一定的心肌细胞的典型性特征结构和一些功能活动。

心肌细胞冻融液法：其制备方式与制备心肌细胞裂解液的方式相似，其作用都是去模拟一个适合心肌细胞生长的环境。关于心肌细胞冻融液法也有很多相关研究。屈佳等[39]通过心肌细胞冻融液在体外模拟心肌微环境时发现，用此种方法可以高效率地将BMSCs诱导分化为心肌细胞，在心肌细胞冻融液环境中培养的BMSCs生长旺盛。除此之外，还包括心肌细胞直接接触共培养法，这3种方法均可提高BMSCs的诱导效率。但在诱导过程中，细胞密度、血清浓度等都会影响诱导的结果。

间接接触共培养主要是利用Transwell小室，通过两种细胞不接触的方式模拟心肌微环境，从而影响心肌细胞的诱导效率。Haneef等[40]在研究中增加了心肌细胞共培养组。结果证实，在白介素-7转染的BMSCs和心肌细胞共培养组中，诱导分化的心肌细胞数量显著增加。Li等[41]通过将Nkx2.5或GATA-4外源基因转染至心肌细胞，并增加心肌外环境共同培养，证实该方法可提高BMSCs向心肌细胞分化的效率。

与直接接触培养相比较，间接接触培养可以规避直接接触后不确定因素的影响，但是同样存在不足，即不能直接接触可能会导致缺少细胞间的牵拉等一些物理因素的影响，总之主要的诱导机制仍需进一步的探讨和研究[42-44]。

3.3 物理因素

心脏是在一个复杂的环境中通过自身的动力维持全身血液的正常运行，其外部环境包括化学、力学、电学等3种因素。

力学因素：主要是机械刺激，基于生物学基础和Frank-Starling机制，心肌细胞收缩力增加时，舒张期的心肌纤维的拉伸力也会随之增加[45]。心肌细胞在收缩的时候能够产生一定的血流动力学作用，从而促进心脏的发育，并且能够诱导心肌相关的基因表达分化，所以机械刺激可以加快心肌细胞成熟。有学者发现，通过对细胞施加牵张力或流动剪切应力，可以提高心肌细胞的成熟[46]。力学生物学概念提出后，很多学者对心肌细胞增殖分化和力的关系进行了研究。尽管相关研究并不多，但是早在1990年，Komuro等[47]研究发现力学拉伸确实对心肌有增强作用。此外，Wang等[48]在2000年的时候发现，周期力学可以增强心肌方面蛋白的表达如Cx43。同年，Ruwhof等[49]发现力学刺激能够使心肌及心肌成纤维细胞产生生物因子。Huang等[50]应用了流体剪切应力(FSS)通过流动腔中的培养液循环流动对MSCs施加剪切应力，在稳定层流条件下，大鼠的BMSCs在剪切应力为10 dyne/cm2的时候表现出最显著的心肌细胞定向分化。Huang等[51]还发现10%牵张应力、1 Hz频率、24 h为骨髓间充质干细胞诱导分化心肌细胞的最佳条件。充分证实了不同强度、不同频率、不同时间的动态牵张应力对心肌方向相关基因表达会产生不同的作用。牵张应力和流动剪切应力是现在研究中最常见的机械应力。

电学因素：电脉冲传导与心脏的节律性搏动有关，因此电场环境对心肌细胞的形成具有一定的作用。体外电刺激可以对心肌细胞实现定向的控制。到目前为止，在组织工程中，已经开始应用电刺激去改善心脏的收缩和导电性能，从而加强干细胞的增殖分化。Tandon等[52]通过构建微型细胞培养系统，使用电刺激培养细胞，发现人脂肪干细胞经过6 d的电刺激，在2 ms持续时间1 Hz、180 μm宽电极、间距200 μm的条件下脂肪来源的干细胞表达更多的Cx43。Radisic等[53]应用电脉冲来刺激增强心肌细胞的分化，8 d后发现受刺激的结构显示出显著的超微节后分化水平，并且在某些方面与天然心肌相似。

3.4 其他因素

3.4.1 单体及复方中药 为了建立一个完整的诱导体系，经过研究者不断的探索，除了常见的化学诱导剂、细胞因子等外，单体及复方中药也在逐渐成为研究者研究的诱导分化剂，如丹酚酸B、黄芪甲苷等。黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ，As-Ⅳ)是中药黄芪的有效成分之一。有研究发现，含有As-Ⅳ的黄芪注射液，在心力衰竭治疗方面有显著作用，提示其具有类似强心苷类药物的正性肌力作用[54]。丹酚酸B(Sla-B)是丹参的有效成分，能够保护心肌细胞，防止心肌损伤[55]。心肌细胞发生氧化损伤时，Sla-B可以起到保护心肌细胞的作用[56]。人参皂苷Rh2是人参的有效成分之一，对心血管疾病具有一定的作用[57]。王乐等[58]的研究发现，在体外，人参皂苷Rh2可显著增强催产素诱导BMSCs向心肌细胞的转化。表皮生长因子可以激活PI3K/Akt信号，促进BMSCs增殖和迁移[59]，人参皂苷Rh2也可能是通过该信号通路促进BMSCs增殖的[60]。由于中药成分复杂，对中药成分的提纯具有严格的要求，因此还需要进一步探究。

3.4.2 基因转染 病毒载体是基因转染中的重要工具。在构建病毒载体时，为确保安全性，病毒载体必须经过改造才能投入应用。改造方式就是剔除病毒复制所需的基因和致病基因，形成的空间再插入所需的目的基因。这样经过改造后的病毒，既可以保留感染性又无致病性，才能成为介导治疗基因进入细胞的良好载体。目前常用的载体有慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等[61]。这些载体在应用中存在一些问题：反转录病毒载体仅仅感染分裂期的细胞，而腺病毒载体存在的主要问题是基因组相对较大，构建起来相对复杂，而且治疗基因不能长期表达，还容易引起免疫反应[62]。慢病毒载体主要是以人类免疫缺陷病毒HIV为基础的载体，可感染大多数细胞，并可以长时间稳定表达外源基因[63]。

有研究证明通过构建过表达微小RNA-1(miR-1)重组慢病毒表达载体，BMSCs向心肌细胞方向分化的效率与质粒载体相比明显增强[64]。李诗鹏等[62]发现与腺病毒相比，慢病毒载体介导BMP-2转染BMSCs时，在转导效率和持续时间上具有一定优势。

4 展望

在BMSCs向心肌细胞方向分化的过程中，有众多因素影响着分化的效率，本文综合讨论了各种诱导方法，但是缺乏关于BMSCs在心血管疾病方面应用的论述。尽管能够体外诱导出心肌样细胞，但是依然存在很多问题需要进一步的探讨。随着研究的深入，在发现其干细胞表现的优越性的同时，也发现了一些问题。第一是关于BMSCs自身的问题，体外获取的干细胞是否是纯化的干细胞，是否是真正意义上的干细胞，以及体外扩增的干细胞的可控性，包括今后在临床上应用后是否可以监控都还有待商榷。第二是关于诱导方法，诱导剂法是利用率最高的方法，但随着新的诱导剂的不断出现，化学诱导剂是否具有一定的细胞毒性，是否影响诱导后的心肌细胞分化效率以及是否存在临床上应用的安全隐患，都是需要考虑的问题。第三是诱导分化后的心肌细胞是否是真正意义上的心肌细胞，是否与天然的心肌细胞的特性一致，除了具有的表型特征外还是否具有心肌细胞的其他功能。第四是BMSCs向心肌细胞方向分化的具体机制需要进一步明确。